p38MAPK活化在苦參堿誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡中作用的研究

劉占術(shù)， 羅章琴， 張紅賓， 陳建斌*， 楊澤松， 黃 曦， 黃宗干

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院血液內(nèi)科，重慶 402160;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，重慶 400016;3.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院腫瘤血液中心，重慶 401520)

細(xì)胞為研究對(duì)象，探討苦參堿在誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡過(guò)程中對(duì)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路交匯點(diǎn)的p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen－activated protein kinase ，p38MAPK)的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物 苦參堿由吉林玉皇藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，分 子量 248.36，批 準(zhǔn)文 號(hào):國(guó) 藥準(zhǔn) 字H20031000，產(chǎn)品批號(hào):20080908，5mL:50mg，4℃ 保存。

1.2 主要試劑與器材 Annexin V－FITC/PI雙標(biāo)記染色試劑盒、蛋白提取試劑盒以及ECL發(fā)光試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);P－p38MAPK與Caspase－3抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);β－actin抗體以及羊抗兔IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司);BCA試劑盒以及SB203580(碧云天生物技術(shù)研究所);FACStar－plus型流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))，凝膠圖像分析儀(Bio－Rad公司，美國(guó))。

1.3 細(xì)胞 Raji細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院惠贈(zèng)。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) Raji細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，另加青霉素和鏈霉素各100U/mL，于37℃、5%CO2的飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，2－3d換液傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 AnnexinV－FITC/PI雙標(biāo)記染色檢測(cè)Raji細(xì)胞凋亡率 根據(jù)本課題前期實(shí)驗(yàn)研究［5］，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL，接種于7個(gè)100 mL的培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，取其中3個(gè)培養(yǎng)瓶加入苦參堿(終濃度為0.4 mg/mL，0.8 mg/mL，1.6 mg/mL)，再取3個(gè)培養(yǎng)瓶先加入10μmol/L SB203580 1 h后加入苦參堿(終濃度同上)，并設(shè)立對(duì)照組，作用Raji細(xì)胞48 h后，2 000 r/min，離心5 min，4℃預(yù)冷的 PBS洗滌2次，收集細(xì)胞后，按照

AnnexinV－FITC/PI雙標(biāo)記染色參考試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4.3 Western blot檢測(cè) P－p38MAPK、Caspase－3 蛋白表達(dá)量的變化 細(xì)胞處理同上，每組收集1×107個(gè)以上細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，3 000 r/min，5 min后，棄上清，然后按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，最終得到蛋白提取物。用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取總蛋白30μg，算出每組的上樣量后加入配好的10%SDS－PAGE進(jìn)行凝膠電泳(濃縮膠:60 V，30 min;分離膠:100 V，1 h)分離目的蛋白;然后在250 mA，1 h條件下將目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用含5 g脫脂奶粉的TBST 100 mL，室溫封閉2 h;分別加1∶200稀釋的兔抗人P－p38MAPK和1∶100稀釋的Caspase－3抗體，4℃孵育過(guò)夜，用TBST漂洗10 min×3次;加1∶3 000稀釋的過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗，室溫孵育2 h;用TBST漂洗10 min×3次，然后進(jìn)行ECL發(fā)光，用凝膠圖像分析儀曝光拍照。將硝酸纖維素膜用洗脫液漂洗1 h以去除上一次結(jié)合的抗體，再分別與1∶500稀釋的抗βactin抗體4℃孵育，漂洗，孵育二抗再漂洗后，掃描蛋白印跡條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用Quantity One分析軟件對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行灰度掃描，結(jié)果用目的蛋白/β－actin灰度值之比表示。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對(duì)Raji細(xì)胞凋亡的影響0.4、0.8、1.6 mg/mL

苦參堿作用Raji細(xì)胞48 h后，其總凋亡率分別為(15.77±0.53)%、(27.88±1.52)%、(48.08±2.87)%，與加入SB203580比較(11.48±0.64)%、(19.34±0.91)%、(33.98±1.26)%具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，與對(duì)照組(8.78±0.66)%相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01);苦參堿不同濃度組間比較也具有統(tǒng)計(jì)差異(P＜0.05，P＜0.01)(見(jiàn)圖1、2)。

2.2 苦參堿對(duì) Raji細(xì)胞 P－p38MAPK、Caspase－3 蛋白含量的影響

圖1 不同濃度Mat以及在此基礎(chǔ)上加入SB203580后誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡Fig.1 Apoptosis of Raji cells induced by different final concentrations of matrine or combined with 10 μmol/L SB203580

圖2 不同濃度Mat以及在此基礎(chǔ)上加入SB203580后誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡率(ˉx ±s，%，n=3)Fig.2 Apoptosis rate of Raji cells induced by different final concentrations of matrine or combined with 10 μmol/L SB203580(ˉx ± s，% ，n=3)

如圖3所示，0.4、0.8、1.6 mg/mL苦參堿作用Raji細(xì)胞 48h后，P－p38MAPK灰度比值分別為(1.06±0.05)、(1.98±0.07)、(3.43±0.11)，與對(duì)照組(0.61±0.04)比較具有統(tǒng)計(jì)差異(P＜0.01)，在加入抑制劑后其灰度比值分別為(0.76±0.04)、(1.53±0.06)、(2.60±0.09)，加入抑制劑前后相比較差異顯著(P＜0.01);同樣，Caspase－3灰度比值分別為(0.53±0.01)、(1.03±0.02)、(1.49±0.02)，與對(duì)照組(0.36±0.01)比較有統(tǒng)計(jì)差異(P＜0.01)，加入抑制劑后其灰度比值分別為(0.42±0.02)、(0.76±0.02)、(1.12±0.02)，加入抑制劑前后相比較也具有明顯差異(P＜0.01)，通過(guò)相關(guān)性分析，二者明顯相關(guān)(r=0.944);在苦參堿各濃度組之間，P－p38MAPK、Caspase－3 蛋白差異顯著(P＜0.01)。

圖3 各組Raji細(xì)胞P-p38MAPK、caspase-3蛋白的表達(dá)Fig.3 The expression of P-p38MAPK and caspase-3 protein in every Raji cell groups

3 討論

Burkitt＇s淋巴瘤是具有高度侵襲性的B細(xì)胞腫瘤，目前治療主要采用大劑量化療，雖其完全緩解率為75% ～90% ，總生存率達(dá)50% ～70%，但因化療副作用極大和化療后極易復(fù)發(fā)［6］，使尋求高效低毒抗腫瘤藥物成為必要。最近研究表明［1－5］作為傳統(tǒng)中藥的苦參堿具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，目前對(duì)其機(jī)制主要集中在對(duì) p53、Fas、FasL、Bax、Bcl－2 等基因的研究［7－9］，對(duì) p38MAPK 在該機(jī)制中的研究較少，本實(shí)驗(yàn)以Raji細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)P－p38MAPK(活化的 p38MAPK)，來(lái)證明 P－p38MAPK與苦參堿誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。

p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是生物信號(hào)引起核反應(yīng)的重要通路，激活的P38MAPK通過(guò)磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控特定基因表達(dá)，導(dǎo)致蛋白合成、細(xì)胞表面受體表達(dá)、細(xì)胞骨架重構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡［10］。本研究流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡率隨苦參堿的濃度的提高而增加，在加入p38MAPK抑制劑后，凋亡率有所下降，這說(shuō)明P－p38MAPK與苦參堿誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡具有相關(guān)性。為此，本研究又采用Western blot檢測(cè)了P－p38MAPK和 Caspase－3蛋白的含量，結(jié)果顯示隨苦參堿濃度的增加，二者表達(dá)量均增加，在加入p38MAPK抑制劑后，二者表達(dá)降低，這與細(xì)胞凋亡率的結(jié)果一致，同時(shí)，相關(guān)性分析結(jié)果也顯示 P－p38MAPK與 Caspase－3明顯相關(guān)，這在Wang等［6］的研究中也得到證實(shí)。

目前p38MAPK通路與細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚，Wang 等［11］發(fā)現(xiàn) Fas－放線(xiàn)菌素 D 誘導(dǎo) Bel－7402細(xì)胞凋亡是通過(guò)p38MAPK在細(xì)胞核與Caspase－3結(jié)合后激活 Caspase－3實(shí)現(xiàn)的。張玉軍等［12］卻發(fā)現(xiàn)p38MAPK上調(diào)Fas/FasL導(dǎo)致Caspase－3活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，因此推測(cè)p38MAPK在凋亡過(guò)程中具有雙重作用，但最后凋亡的執(zhí)行都是由活化的Caspase－3 完成的。

綜上所述，我們研究表明苦參堿可通過(guò)激活p38MAPK來(lái)直接或間接激活Caspase－3蛋白，進(jìn)而使Raji細(xì)胞凋亡，該機(jī)制的闡明為苦參堿抗腫瘤作用提供充分的理論依據(jù)。

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