百草枯中毒大鼠肺TGF-β1和c-Jun的表達(dá)及姜黃素的干預(yù)作用

吳偉，劉瑩，胡明，于淼淼

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽 110001；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院急診科，天津 300000；3.北京306醫(yī)院急診科，北京100101；4.遼寧省腫瘤醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房，沈陽 110001）

百草枯（paraquat，PQ）是目前世界范圍內(nèi)廣泛使用的除草劑，化學(xué)名稱為 1，1′-二甲基-4，4′-聯(lián)吡啶二氯化物。其毒性高，服用PQ自殺的患者死亡率達(dá)73.4%。大劑量PQ中毒者可在短期內(nèi)出現(xiàn)多臟器功能障礙，這是PQ中毒患者早期死亡的主要原因［1］，而度過急性期的患者多死于肺纖維化［2］。PQ中毒致肺纖維化的機(jī)制尚未闡明，迄今仍無特效治療藥物。姜黃素（curcumin）具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用。近期研究發(fā)現(xiàn)它有抗纖維化作用，可減輕博來霉素和胺碘酮所致肺纖維化、減少肺組織膠原沉積［3］。本文通過觀察姜黃素減輕PQ中毒大鼠肺間質(zhì)纖維化，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

8周齡清潔級Wistar雄性大鼠80只，體質(zhì)量200~300 g，購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。PQ 20%水溶液（商品名克無蹤），購自先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司。原癌c-jun基因抗體、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）抗體，購自美國SANTA CRUZ公司。SP-9001免疫組化試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）測試盒，購自南京建成生物工程研究所。姜黃素（貨號C1386），購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組：將80只大鼠飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為PQ中毒組（PQ組）和姜黃素干預(yù)組（PC組），每組40只。PQ組和PC組動物按觀察時點(diǎn)（1、3、7、14和21 d）分成5個亞組。在相同條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。

1.2.2 動物模型的建立：20%PQ溶液蒸餾水稀釋20倍，配置成濃度為10 mg/ml溶液，避光保存。姜黃素用玉米油混懸，配置成100 mg/ml濃度的混懸液。造模前，各組大鼠禁食水10 h。PQ組和PC組大鼠按50 mg/kg一次性灌胃染毒［4］。灌胃給藥途中未有嘔吐、抽搐或未完全灌入所需藥量等情況。灌胃后2 h，PC 組大鼠按 200 mg·kg-1·d-1給予姜黃素 1 次腹腔內(nèi)注射，PQ組大鼠按體質(zhì)量給予相應(yīng)體積生理鹽水腹腔內(nèi)注射，最長給藥時間21 d。每日上午固定時間給藥。造模后，各組動物飼養(yǎng)條件如前，每日上午固定時間測定動物體質(zhì)量。觀察動物進(jìn)食、進(jìn)水、排泄情況，有無精神反應(yīng)遲鈍、毛蓬松、毛色黯淡、鼠尾紫紺、呼吸困難及干濕啰音、攻擊性降低、死亡等情況。在灌胃后1、3、7、14和21 d，各組到達(dá)各自觀察終點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)動物稱質(zhì)量。

1.2.3 麻醉及取材：10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉。麻醉充分后將大鼠仰臥于鼠臺上固定，開胸，完整取出兩側(cè)肺組織，觀察肺組織顏色、質(zhì)地、有無出血及梗死灶等大體病理變化。生理鹽水清洗后濾紙吸干表面水分，稱量肺濕質(zhì)量，計(jì)算肺系數(shù)，肺系數(shù)=肺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。右肺葉4%多聚甲醛固定，用于檢測 TGF-β1、c-Jun及 HE 染色、Masson染色，左肺葉液氮速凍后置于-80°C冰箱保存用以檢測HYP。

1.2.4 肺部組織學(xué)檢查：取固定的肺組織，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、連續(xù)切片備用（HE染色、Masson染色、免疫組織化學(xué)染色）。Masson染色結(jié)果判定以呈綠色（或藍(lán)色）為膠原纖維，用病理圖像分析儀進(jìn)行灰度面積掃描，取陽性面積百分比作為肺纖維化程度的半定量參數(shù)。

1.2.5 肺組織HYP測定：采用樣本堿水解法。

1.2.6 肺組織TGF-β1及c-Jun表達(dá)的免疫組化染色及半定量分析：TGF-β1免疫組化結(jié)果以胞質(zhì)出現(xiàn)棕色或棕黃色為陽性，c-Jun免疫組化結(jié)果以胞質(zhì)及胞核出現(xiàn)棕色或棕黃色為陽性。在200倍鏡下用圖像分析系統(tǒng)測量其光密度，每張切片隨機(jī)檢測5個視野，然后計(jì)算出平均光密度（mean optical density，MOD）值，以 MOD 作為 TGF-β1、c-Jun 表達(dá)水平半定量參數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以x±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間率的比較用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動物一般情況觀察結(jié)果

PQ組動物在一次性灌胃染毒后30 min~2 h逐漸出現(xiàn)中毒反應(yīng)，出現(xiàn)呼吸急促、進(jìn)食進(jìn)水量減少或不進(jìn)食水、精神反應(yīng)差、行為靈敏度降低、行動協(xié)調(diào)性差、攻擊性低、少動、毛蓬松、毛色污穢、鼠尾發(fā)紺、口鼻可見血性分泌物、腹瀉等表現(xiàn)。中毒表現(xiàn)以1~3 d最明顯。實(shí)驗(yàn)動物均出現(xiàn)體質(zhì)量下降或不增，甚至部分動物在1~3 d可聞及較明顯的干濕啰音。PC組動物染毒后中毒反應(yīng)較PQ組明顯減輕，進(jìn)食水較正常，體質(zhì)量下降不明顯，未見腹瀉及口鼻出血，精神好，反應(yīng)較靈敏，毛色較潔凈，較少出現(xiàn)呼吸急促、鼠尾發(fā)紺等表現(xiàn)。

2.2 動物的生存率差異

21 d后，PQ組動物生存率為35%，PC組生存率為67%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)兩組生存率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.040，df=1，P<0.05）。

2.3 動物的肺組織病理學(xué)表現(xiàn)

2.3.1 大體組織觀察：PQ組1 d肺組織色紅、充血、腫脹、彈性差，肺葉可見彌漫性出血點(diǎn)或大塊出血梗死灶；3 d肺組織色暗紅，質(zhì)硬，肝樣變，亦可見彌漫性出血或梗死灶，部分動物可見胸腔積液；7 d可見肺臟腫脹減輕，顏色變淺，可見散在出血點(diǎn)、片狀透明樣變；14 d肺臟呈灰白色，腫脹基本消退，有斑點(diǎn)狀陳舊出血點(diǎn)；21 d雙肺蒼白，肺彈性差，硬度增加，表面有索條狀凹溝，可見小囊形成。PC組各時點(diǎn)肉眼變化與PQ組相近，但程度較輕；1 d時肺組織輕度充血，色粉紅，體積略增大，部分可見點(diǎn)狀出血灶；3 d肺組織腫脹較輕，色稍暗，部分可見彌漫性出血點(diǎn)或片狀梗死灶，未見胸腔積液；7 d雙肺淡紅，體積稍增大，表面散在出血點(diǎn)；14 d雙肺淡紅，局部可見陳舊出血點(diǎn)；21 d雙肺體積無明顯改變，硬度稍增加，表面較光滑，部分可見散在小結(jié)節(jié)。

2.3.2 肺系數(shù)：PQ組與PC組比較，肺系數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.3.3 HE染色光鏡下病理表現(xiàn)：PQ組染毒后1 d可見肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，氣管及血管周圍有不同程度的水腫，肺內(nèi)小灶狀或大片狀炎性細(xì)胞浸潤；3 d肺間質(zhì)和肺泡水腫達(dá)高峰，部分肺泡腔充滿粉染均質(zhì)水腫液，部分有透明膜形成，彌漫性肺出血，肺泡腔塌陷，肺泡腔內(nèi)大量游離的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；7 d肺泡炎性表現(xiàn)較前有所減輕，但仍有出血及水腫，可以見到成纖維細(xì)胞；14 d成纖維細(xì)胞增生，肺泡間隔明顯增寬，有膠原沉積及斑片狀的纖維化改變；21 d病變范圍彌散，大量肺泡結(jié)構(gòu)萎陷、破壞，大量膠原沉積，肺泡間隔以及部分肺泡腔被膠原和纖維蛋白占據(jù)，偶見部分殘存的肺泡腔過度膨脹，出現(xiàn)代償性肺氣腫。PC組各時點(diǎn)病理變化較PQ組相似，但程度較輕；1 d時可見肺泡壁毛細(xì)血管充血，肺內(nèi)小灶狀炎性細(xì)胞浸潤，肺組織結(jié)構(gòu)較正常；3 d部分肺組織可見水腫液，肺泡腔內(nèi)可見出血及炎細(xì)胞浸潤，周圍較多正常肺組織；7 d見陳舊出血灶，炎細(xì)胞少，可見成纖維細(xì)胞；14和21 d少量肺泡萎陷，可見膠原沉積，周圍較多正常肺組織。見圖1。

2.3.4 肺組織Masson染色：在支氣管周圍及肺泡間隔區(qū)可見藍(lán)染膠原。1、3、7 d PQ組無明顯膠原增生，與PC組比較Masson染色陽性面積百分比（藍(lán)染膠原面積/組織整體面積）的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。14和21 d PQ組藍(lán)染膠原沉積明顯增多，與PC組比較Masson染色陽性面積百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖 2，表 1。

2.4 肺組織HYP含量測定結(jié)果

PC組與PQ組相比HYP含量減少，14和21 d兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。見表1。

2.5 肺組織TGF-β1免疫組化結(jié)果及半定量分析

中毒7 d后TGF-β1的MOD值顯著增高，PQ組14 d TGF-β1達(dá)峰值。PQ與PC組比較，14 d和21 d兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖3，表1。

2.6 肺組織c-Jun免疫組化結(jié)果及半定量分析

1、3、7 d兩組大鼠肺組織內(nèi)c-Jun的MOD明顯增高，14 d后明顯回降。3和7 d PC組肺組織內(nèi)c-Jun MOD值較PQ組降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖 4，表 1。

表1 各組大鼠肺系數(shù)、Masson染色、HYP含量、TGF-β1和c-Jun的比較（x±s）Tab.1 The lung index，Masson staining，HYP，TGF-β1，and c-Jun expression（x±s）

3 討論

PQ 20%水溶液口服入血后，約有50%分布集中于肺組織，所致彌漫性肺泡損傷最為突出。急性肺損傷早期出現(xiàn)炎性反應(yīng)和修復(fù)過程同時存在不均一性特征。PQ進(jìn)入機(jī)體后產(chǎn)生氧自由基，損傷毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞，使肺泡表面活性物質(zhì)減少或失活，肺泡壁的完整性被破壞，肺泡腔內(nèi)堆積大量的炎性滲出物［5］。動物實(shí)驗(yàn)PQ致肺損傷的演變過程可分為染毒后1~7 d，肺泡炎、肺水腫、肺出血；7~14 d，水腫消減后修復(fù)機(jī)化；21 d以后，明顯纖維疤痕形成［6］。本實(shí)驗(yàn)采用 Hemmati［4］的方法，取 1、3、7、14和21 d五個觀察時點(diǎn)。染毒后大鼠可出現(xiàn)體質(zhì)量下降、呼吸急促、鼠尾紫紺等表現(xiàn)。肉眼觀察PQ組大鼠1和7 d肺臟明顯腫脹，顏色晦暗，散在點(diǎn)片狀淤斑、出血點(diǎn)；14 d肺臟呈灰白色，腫脹基本消退，有斑點(diǎn)或斑片狀實(shí)變灶形成；21 d雙肺蒼白，肺彈性差、硬度增加。光鏡下PQ組大鼠肺組織1和7 d內(nèi)表現(xiàn)為肺泡炎性改變明顯，可見肺泡間隔水腫增厚，結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，伴有水腫和出血；14 d肺泡炎有所減輕，但仍有出血及水腫，成纖維細(xì)胞增生，肺間隔明顯增寬，有膠原沉積及斑片狀的纖維化改變；21 d肺泡炎較前減輕，炎性細(xì)胞減少，大量肺泡結(jié)構(gòu)萎陷、破壞，大量膠原沉積在新生的毛細(xì)血管周圍。說明PQ中毒肺損傷1周內(nèi)以肺泡炎為主，2周后出現(xiàn)肺纖維化。

近年來，人們逐漸把PQ致肺纖維化機(jī)制從病變部位細(xì)胞成分的變化轉(zhuǎn)移到由各種細(xì)胞釋放的各種生物活性分子上來。在參與肺纖維化的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中，TGF-β被公認(rèn)為纖維化形成與發(fā)展的啟動樞紐。TGF-β1促肺纖維化主要是通過促肺成纖維細(xì)胞的活化、增殖、轉(zhuǎn)化作用和調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)合成作用。本研究結(jié)果顯示，PQ組損傷區(qū)的肺泡壁巨噬細(xì)胞、浸潤的炎細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞均有TGF-β1表達(dá)；且TGF-β1表達(dá)從染毒后即開始升高，14 d左右達(dá)峰值，并且PQ組大鼠肺組織在14 d后肺泡間隔變厚、膠原沉積已明顯，肺纖維化初步形成，再結(jié)合TGF-β1的功能，這也與肺纖維化的形成時間相吻合。TGF-β1屬于被激活的激活蛋白 1（activator protein-1，AP-1）調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄的應(yīng)答基因，即AP-1促進(jìn)TGF-β1表達(dá)使Ⅰ型膠原mRNA的轉(zhuǎn)錄和分泌增加［7］。PQ肺組織中AP-1的亞基c-Jun的表達(dá)水平及變化趨勢，可以初步反映PQ肺組織中的AP-1的表達(dá)情況。本研究結(jié)果顯示，PQ染毒后肺損傷區(qū)的肺泡巨噬細(xì)胞、浸潤的炎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞胞漿及胞核中均有陽性表達(dá)。結(jié)合染毒組大鼠肺組織c-Jun的MOD值從1 d起即升高，3 d達(dá)峰值，14 d時降低表達(dá)水平，推測在PQ肺損傷/肺纖維化情況下AP-1被激活，并在較早期參與調(diào)控TGF-β1的表達(dá)。

早期應(yīng)用姜黃素可以減輕肺纖維化程度，對肺纖維化具有預(yù)防作用。Venkaesan等［8］發(fā)現(xiàn)姜黃素可降低PQ中毒大鼠支氣管肺泡灌洗液內(nèi)蛋白含量，減輕PQ對肺組織的損害，降低PQ中毒大鼠的死亡率。本研究發(fā)現(xiàn)，PC組較同時點(diǎn)PQ組肺系數(shù)值小，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明其干預(yù)PQ中毒大鼠肺水腫作用不明顯。PC組HE染色成纖維細(xì)胞增殖、肺泡萎陷、膠原沉積的情況相對較輕；Masson染色結(jié)果14 d時PC組肺纖維化程度較PQ組輕；HYP含量14 d后明顯低于PQ組，說明姜黃素明顯減輕PQ肺纖維化的程度。從治療14 d開始PC組TGF-β1表達(dá)水平明顯低于PQ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明姜黃素干預(yù)性治療PQ中毒大鼠，通過降低TGF-β1的過度表達(dá)抑制其促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積、阻止肺纖維化形成，這是姜黃素發(fā)揮其抗肺纖維化作用重要機(jī)制之一。姜黃素能明顯減輕肺炎性反應(yīng)，降低肺組織中TNF-α及TGF-β1水平，因?yàn)椴粌H抑制核因子κB，也抑制了一種與炎性反應(yīng)及纖維化都密切相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活化，從而下調(diào)了一系列與纖維重構(gòu)相關(guān)基因。Kang等［9］認(rèn)為，姜黃素通過抑制膠原基因轉(zhuǎn)錄，下調(diào)膠原mRNA來抑制膠原的沉積。Ammon等［10］認(rèn)為姜黃素抗纖維化的作用可能只是它抗氧化損傷作用的結(jié)果，它通過減輕肺組織炎性反應(yīng)和巨噬細(xì)胞的活化，減輕氧化應(yīng)激和膠原沉積。Gaedeke等［11］利用TGF-β活化VRK49F大鼠腎成纖維細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過抑制TGF-β與其膜受體TGF-βⅡ受體（TβRⅡ）的結(jié)合，阻礙SMAD磷酸化；抑制轉(zhuǎn)錄因子c-Jun和NF-κB活性，下調(diào)TβRⅡmRNA的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)TGF-β對腎成纖維細(xì)胞致纖維活化活性的誘導(dǎo)。本研究PC組c-Jun升高，表達(dá)水平雖較同時點(diǎn)PQ組低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，顯示姜黃素對PQ肺組織中c-Jun表達(dá)無明顯抑制。結(jié)果不排除實(shí)驗(yàn)樣本量或其他客觀實(shí)驗(yàn)條件造成的結(jié)果，需要進(jìn)一步研究。

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