不規(guī)則抗體篩選方法的比較

李煒華

(江蘇省宿遷市中心血站,江蘇 宿遷 223800 E-mail:sqltdr@126.com)

不規(guī)則抗體是指除ABO血型系統(tǒng)以外的所有抗體。對(duì)受血者的血漿做常規(guī)的抗體篩選試驗(yàn)以發(fā)現(xiàn)有臨床意義的不規(guī)則抗體,從而避免輸血的不良反應(yīng),保證臨床用血的安全,特別是對(duì)有輸血史和妊娠史的擇期手術(shù)患者有更為重要的臨床意義?？贵w檢測(cè)還可以協(xié)助臨床診斷自身溶血性貧血、新生兒溶血病及溶血性輸血反應(yīng)。由于篩選方法較多,靈敏度、準(zhǔn)確性和重復(fù)性均有所不同,故各實(shí)驗(yàn)室采用的方法不同。筆者對(duì)2009年12月1日～2010年11月30日期間各醫(yī)院送至本站的需輸血患者的血漿進(jìn)行抗體篩選,并對(duì)陽(yáng)性的標(biāo)本分別用鹽水法、凝聚胺法、抗人球蛋白法、微柱凝膠免疫檢測(cè)法進(jìn)行了檢測(cè),并對(duì)結(jié)果、靈敏度、所用時(shí)間及所用血漿量進(jìn)行了比較與分析,現(xiàn)報(bào)告如下:

1 材料與方法

1.1 材料 篩選紅細(xì)胞由上海輸血技術(shù)有限公司提供;凝聚胺由BASO公司提供;抗人球蛋白試劑由上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司提供;微柱凝膠免疫檢測(cè)卡由長(zhǎng)春博迅生物制品有限公司提供;免疫微柱孵育器及血型血清學(xué)多用離心機(jī)均由長(zhǎng)春博研科研儀器有限公司提供。

1.2 標(biāo)本 2009年 12月 1日～2010年11月30日各醫(yī)院送至本站的需輸血患者的血漿,共計(jì)3 020份。

1.3 方法

1.3.1 鹽水法 在標(biāo)記好的試管中加入2滴待檢血漿,再加入1滴篩選紅細(xì)胞,3 000r/min離心15s后,輕輕搖動(dòng)觀察有無(wú)凝集,肉眼無(wú)法確認(rèn)的,用顯微鏡觀察。

1.3.2 凝聚胺法 在標(biāo)記好的試管中,分別加入篩選紅細(xì)胞各1滴,待檢血漿 2滴,然后加入 LIM液4滴,Polybrene液2滴,3 500r/min離心10s,傾去上清。輕輕搖管,判斷有無(wú)凝集。若無(wú)凝集,則應(yīng)重做試驗(yàn)。再加入重懸液2滴,輕輕搖動(dòng)試管,觀察凝集并判讀結(jié)果。若凝集消散,表明待檢血漿中不含有與已知紅細(xì)胞上抗原相對(duì)應(yīng)的抗體;反之,則表明待檢血漿中含有與已知紅細(xì)胞上抗原相對(duì)應(yīng)的抗體。

1.3.3 抗人球蛋白法 在標(biāo)記好的試管中加血漿2滴,再加1滴篩選紅細(xì)胞,37℃孵育30min,用足量生理鹽水洗滌3～4次,所用鹽水量不得少于試管容量的3/4,加鹽水前要把細(xì)胞充分搖散,加鹽水時(shí)要有沖力,能充分混勻。每次傾倒鹽水要瀝干,管口要吸干,加抗人球試劑1～2滴,立即離心讀取結(jié)果。如為陰性需加入已致敏的陽(yáng)性紅細(xì)胞,離心看結(jié)果,結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性,此陰性為真實(shí)結(jié)果,同時(shí)還需做陰、陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.4 微柱凝膠免疫檢測(cè)法 將微柱凝膠試劑卡的微管做好標(biāo)記,分別加入篩選紅細(xì)胞懸液50μ l于管中,再加入待檢血漿50μ l,同時(shí)加入陰、陽(yáng)性對(duì)照血漿各50μ l。陰性對(duì)照血漿取自健康成年男性AB型血漿。加樣后置孵育器中孵育15min,然后使用血型血清學(xué)多用離心機(jī)離心,900r/min 2min,1 500r/min 3min,肉眼觀察結(jié)果。結(jié)果判定參照使用手冊(cè)。

2 結(jié)果

2.1 四種方法檢測(cè)結(jié)果的比較 檢測(cè)的3 020余份標(biāo)本中共檢出11例不規(guī)則抗體,檢出率為0.37%。用凝聚胺法測(cè)得的陽(yáng)性標(biāo)本再用其它幾種方法所測(cè)結(jié)果的比較見(jiàn)表1?？贵w特異性的鑒定使用譜細(xì)胞。

表1 11份標(biāo)本抗體檢出方法的比較

表2 四種方法出現(xiàn)凝集時(shí)最高稀釋度

2.3 四種方法所用血清量和實(shí)驗(yàn)時(shí)間的比較 見(jiàn)表3。

表3 四種方法所用血清量和實(shí)驗(yàn)時(shí)間的比較

3 討論

四種方法檢測(cè)結(jié)果比較顯示,鹽水法只能檢測(cè)出室溫或低于室溫條件下出現(xiàn)反應(yīng)的IgM類(lèi)型的抗體,如抗M、冷抗體等。冷抗體只在4℃有意義,故臨床意義不大,而大多數(shù)的有臨床意義的不規(guī)則抗體(如 Rh系統(tǒng)的抗體),多為IgG型抗體,又稱(chēng)為不完全抗體,不能在鹽水介質(zhì)中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng),所以鹽水法篩選抗體已逐漸被淘汰,只要條件允許應(yīng)做其它敏感試驗(yàn)。

除鹽水法外,其它3種方法均能檢測(cè)出IgG型抗體,陽(yáng)性符合率均為100%。多種促進(jìn)IgG抗體快速凝集的方法中,以凝聚胺為優(yōu)選,其方法快速,操作簡(jiǎn)單,可引起正常紅細(xì)胞的可逆性凝集,如果被抗體致敏的紅細(xì)胞與Polybrene連在一起,就會(huì)發(fā)生不可逆性凝集,加入重懸液后,抗體介導(dǎo)的特異性凝集將繼續(xù)存在,而非特異性凝集的細(xì)胞將散開(kāi)[1]?？谷饲虻鞍追ㄊ亲顬榻?jīng)典的檢測(cè)不規(guī)則抗體的方法,理論明確清晰,結(jié)果確定,可用于確定性試驗(yàn),絕大多數(shù)有臨床意義的抗體在孵育時(shí)均可以結(jié)合紅細(xì)胞上的相應(yīng)抗原,但不能引起凝集反應(yīng),加入抗球蛋白試劑后能檢出和證實(shí)這種抗體,它是確定臨床不規(guī)則抗體最可靠的方法。微柱凝膠免疫法是紅細(xì)胞膜抗原與相應(yīng)抗體在凝膠介質(zhì)中發(fā)生的凝集反應(yīng),是一種免疫學(xué)檢測(cè)新技術(shù),在一些先進(jìn)國(guó)家,已成為常規(guī)血型血清學(xué)檢測(cè)新技術(shù)[2]。在國(guó)內(nèi),微柱凝膠試驗(yàn)已逐漸進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室,應(yīng)用于血型鑒定、交叉配血、抗體鑒定等試驗(yàn)中,受到工作人員的肯定和好評(píng)[3,4]。它保持了傳統(tǒng)的抗球蛋白試驗(yàn)準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn),克服了其繁瑣費(fèi)時(shí)的洗滌過(guò)程。不必洗滌紅細(xì)胞,不用擔(dān)心抗球蛋白抗體被中和而出現(xiàn)假陰性報(bào)告,不僅節(jié)約了時(shí)間而且也不需要很高的操作技術(shù),最重要是減少了洗滌而導(dǎo)致技術(shù)上的錯(cuò)誤。操作方便、標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果清晰可靠,重復(fù)性好,一卡 6管,減少標(biāo)記,避免錯(cuò)誤,所需標(biāo)本量少,可拍照存檔,存入計(jì)算機(jī)中作為實(shí)驗(yàn)室資料存檔。其靈敏度高,不用顯微鏡,不用反復(fù)重做,有利于推廣,是抗人球蛋白法很好的替代方法,它等同于甚至好于抗人球蛋白法,這也在其他人的研究中得到證實(shí)[5,6]。此法還能用于血型鑒定、交叉配血、骨髓細(xì)胞分型等項(xiàng)目[4]。

凝聚胺結(jié)果不好判斷,要有豐富的實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)。凝聚胺是促凝劑,會(huì)造成細(xì)胞的假凝集,誤判為弱陽(yáng)性。出現(xiàn)弱陽(yáng)性的標(biāo)本還要做抗人球蛋白法,以此結(jié)果為準(zhǔn)。操作中也不能劇烈晃動(dòng),會(huì)使弱凝集消失,誤判為陰性?？谷饲虻鞍追ú僮鲝?fù)雜,時(shí)間長(zhǎng),大規(guī)模檢測(cè)時(shí)受到限制。洗滌是抗人球蛋門(mén)試驗(yàn)的關(guān)鍵步驟,不容易掌握。各種對(duì)照試驗(yàn)都正確,抗球蛋白試驗(yàn)才能確認(rèn)。由于試驗(yàn)需要非常繁瑣的洗滌過(guò)程,需要時(shí)間長(zhǎng),凝集強(qiáng)度的判定不是很清楚,操作人員的主觀因素比較大,操作者對(duì)反應(yīng)終點(diǎn)與結(jié)果判斷需要有一定經(jīng)驗(yàn),對(duì)同一標(biāo)本不同操作者的結(jié)果可能不同,因此不是臨床抗體大規(guī)模篩選時(shí)的常規(guī)方法[2]。特別是1W和(+),只有在顯微鏡下較清楚,振蕩試管過(guò)度用力也會(huì)將弱凝集搖散而判為陰性,且所有結(jié)果不能拍照存檔。微柱凝膠免疫法,需要專(zhuān)用的孵育器和離心機(jī),可在有條件的血液中心和血站推廣。當(dāng)紅細(xì)胞濃度＞5%或＜3%時(shí),紅細(xì)胞被抗體嚴(yán)重包被,或血清蛋白異常時(shí),微柱凝膠免疫法可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性,這是操作者應(yīng)當(dāng)注意的問(wèn)題。

從價(jià)格方面考慮,鹽水法最便宜但不能檢測(cè)出IgG型抗體。凝聚胺法價(jià)格合適,一般實(shí)驗(yàn)室都可以接受。相比較而言,抗人球蛋白法價(jià)格低廉而微柱凝膠免疫法需配備專(zhuān)用的離心機(jī)及孵育器,價(jià)格昂貴。

從所用時(shí)間上看,鹽水法、凝聚胺法時(shí)間較短,抗人球蛋白法所用時(shí)間較長(zhǎng),微柱凝膠免疫法適中。從所用量上看,微柱凝膠免疫法所用血清量是其它方法的1/3～1/2,其它方法所用標(biāo)本量相近。

綜上所述,各種血型血清學(xué)試驗(yàn)都有其自身的特點(diǎn),適用不同范圍及不同情況,故臨床血型工作者應(yīng)熟練掌握這些技術(shù)。選擇足夠的敏感技術(shù)檢測(cè)出受檢者血清中非常有意義的抗體,在臨床輸血中有著極為重要的意義。即使受檢者血清中抗體對(duì)輸入的不相容紅細(xì)胞抗原呈弱反應(yīng),也能夠發(fā)生快速?gòu)?qiáng)的回憶反應(yīng),增加抗體產(chǎn)生,破壞紅細(xì)胞,對(duì)病人造成難以估量的后果。因此每次試驗(yàn)結(jié)果要立即記錄并和病人病歷記錄對(duì)照,確信與前次結(jié)果一致,否則提示可能有錯(cuò),還應(yīng)從病歷中查看是否有過(guò)臨床有意義的紅細(xì)胞抗體,是否有過(guò)血型檢測(cè)的困難,是否曾有過(guò)輸血及輸血反應(yīng)的記錄以及妊娠史等,以確保輸血的安全。已知病人血清中有抗體時(shí),一定要檢測(cè)確認(rèn)準(zhǔn)備輸入的紅細(xì)胞的血液成分有無(wú)相應(yīng)的抗原,并輸注與之相配合的血液。

沒(méi)有一種最理想的單一方法適用于所有標(biāo)本且能檢出所有抗體,因?yàn)槿巳褐写蠹s1%的未經(jīng)選擇的血清可能含有某些低頻率抗原,即使進(jìn)行抗體篩檢也可能為陰性。由于每種方法都有其各自的優(yōu)點(diǎn)和不足,不同的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)從自己的實(shí)際情況出發(fā),選擇適合自己實(shí)驗(yàn)室的方法,以保證臨床輸血的安全,并可為臨床診斷和治療提供有意義的依據(jù)。我站常規(guī)用血、備血用微柱凝膠免疫法,而急診用血比較急,用凝聚胺法作為補(bǔ)充能比較快速的篩選不規(guī)則抗體。

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