四種防脫片劑在不脫鈣骨組織切片中的應(yīng)用研究

王東勝 趙 征 呂 燕

不脫鈣骨組織切片，因包埋介質(zhì)為樹(shù)脂，不同于石蠟切片通過(guò)高溫烘烤，石蠟熔化而使切片完全貼合于載玻片上。玻片在撈取切片前均需進(jìn)行涂布或浸泡防脫片劑的處理。因包埋介質(zhì)的不同，對(duì)于防脫片劑的選擇就會(huì)有差別，如選擇不當(dāng)，切片與載玻片貼合不牢，易出現(xiàn)大量切片脫片的問(wèn)題。針對(duì)不脫鈣骨切片在染色中易脫片的情況，我們對(duì)病理實(shí)踐中常采用的3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷(APES)、鉻明礬-明膠、多聚賴(lài)氨酸、進(jìn)口玻片膠等四種防脫片劑進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，取得了滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.材料與方法

1.1 主要試劑 防脫片劑：3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷(APES)、鉻明礬-明膠、多聚賴(lài)氨酸、已涂防脫片膠的進(jìn)口玻片。Goldner's三色法染色液[1]。

1.2 方法

1.2.1 防脫片劑配制 (1)APES：配制方法為1份APES，50份丙酮，試劑最好現(xiàn)配現(xiàn)用。取潔凈玻片于APES丙酮液中浸泡20s，取出后入丙酮液漂洗一下后取出，于空氣中自然干燥，取出放置于載玻片盒中以防灰塵。處理好的玻片最好于3個(gè)月內(nèi)用完。(2)多聚賴(lài)氨酸：取多聚賴(lài)氨酸原液1份，加10份去離子水，混勻后使用。將潔凈玻片浸泡5min，取出空氣中自然干燥，放置于載玻片盒中。(3)鉻明礬-明膠：將2.5g明膠加熱溶于500 mL蒸餾水中，完全溶解后加入0.25 g硫酸鉻鉀攪拌充分溶解后，將玻片浸泡溶液中2 min，取出空氣中自然干燥，放置于載玻片盒中。在實(shí)際應(yīng)用中，采用浸泡法處理的玻片經(jīng)HE染色后，玻片上易出現(xiàn)明膠干燥后留下的水印，影響切片的觀察。經(jīng)采用臨檢科推血片的方法，使明膠液均勻布滿玻片上，切片染色后顏色均勻一致，取得滿意效果。

1.2.2 不脫鈣切片 采用Leica 2500E重型切片機(jī)制作不脫鈣骨切片，切片厚度5μm。切片分別采用經(jīng)APES、鉻明礬-明膠、多聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的玻片，以及已涂防脫片膠的進(jìn)口玻片撈取。每種防脫片劑處理的玻片撈取20張，用自制夾具夾緊，于50℃烤箱中過(guò)夜。

1.2.3 染色 切片經(jīng)3次脫塑劑處理，每次浸泡20min，由100%乙醇下行入水，切片均用Goldners’三色法染色[1]。

1.2.4 脫片統(tǒng)計(jì) 脫片統(tǒng)計(jì)分四個(gè)等級(jí)：(1)貼片完整(見(jiàn)圖1)；(2)輕度脫片：脫片面積小于10%(見(jiàn)圖 2)；(3)中度脫片：脫片面積為 10%-50%(見(jiàn)圖3)；(4)重度脫片：脫片面積大于50%，或組織全部脫落(見(jiàn)圖4)。

2.結(jié)果

經(jīng)使用四種防脫片劑處理后的玻片撈取不脫鈣骨切片，染色后比較，從附表中可以看出，脫片率最低的是經(jīng)鉻明礬-明膠處理的玻片，完整貼片率為75%；效果最差的是APES處理組，完整貼片率僅為15%；多聚賴(lài)氨酸處理組和進(jìn)口防脫片膠處理組完整貼片率均為30%。

采用經(jīng)鉻明礬-明膠處理的玻片所做的不脫鈣骨切片、帶支架血管切片均取得滿意的效果。

附表 四種防脫片劑帖片效果比較

3.討論

在日常病理制片，特別是對(duì)切片進(jìn)行免疫組化染色時(shí)，對(duì)玻片進(jìn)行防脫片處理是保證制片成功至為關(guān)鍵的一步。以往文獻(xiàn)對(duì)于APES、多聚賴(lài)氨酸和鉻明礬-明膠等多種防脫片劑的比較均有報(bào)道[2-5]。有些研究者還通過(guò)對(duì)玻片表面進(jìn)行多次處理，確保其表面清潔；或?qū)Χ嗑圪?lài)氨酸進(jìn)行改良，以提高其防脫片的效果[6,7]，進(jìn)行了多角度的研究。通過(guò)復(fù)習(xí)文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)以上研究多針對(duì)石蠟切片或脫鈣骨、牙齒切片防脫片劑的選擇[8]，對(duì)不脫鈣骨切片防脫片劑選擇及比較應(yīng)用的研究較少。

我們?cè)谧畛踔谱鞑幻撯}骨切片的實(shí)踐中是采用鉻明礬-明膠對(duì)玻片進(jìn)行浸泡處理，盡管防脫片效果較好，但因防脫片劑干燥后留下的痕跡影響了染色效果，后改用APES進(jìn)行防脫片處理，但實(shí)際效果并不理想。

雖然APES和多聚賴(lài)氨酸是目前病理制片中最為常用的兩種防脫片劑，但從附表比較結(jié)果來(lái)看，其對(duì)于不脫鈣骨切片并非最佳選擇。而已涂防脫片劑的進(jìn)口玻片防脫片效果一般，且價(jià)格昂貴，并不適用于日常病理研究。以上四種防脫片劑中，價(jià)格由高至低依次為：進(jìn)口玻片、多聚賴(lài)氨酸、APES、鉻明礬-明膠。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)比較，防脫片效果由好至差分別為鉻明礬-明膠、多聚賴(lài)氨酸、進(jìn)口玻片、APES。可看出鉻明礬-明膠價(jià)格低，且對(duì)于不脫鈣骨切片防脫片效果優(yōu)良，為最佳選擇。

在以往文獻(xiàn)中使用鉻明礬-明膠對(duì)玻片處理的方法多為浸泡法，但由于玻片的潔凈度、浸泡液的雜質(zhì)殘留量、玻片的平整度等因素，使處理后的玻片表面易留下處理液的痕跡，影響最終的染色效果。我們借鑒臨檢科血液推片法，使用吸管滴加少量鉻明礬-明膠液，緩慢均勻地將液體推布于玻片上，再將玻片直立放置于染色架中，室溫自然干燥后收入切片盒防塵保存，并標(biāo)明方向。經(jīng)此方法處理后的切片，解決了原浸泡法產(chǎn)生的“花片”問(wèn)題，提高了切片的制作質(zhì)量。在玻片處理中應(yīng)根據(jù)制作切片的數(shù)量準(zhǔn)備玻片，處理好的玻片存放時(shí)間不宜超過(guò)三個(gè)月，尤其是夏天。因明膠主要為蛋白質(zhì)成份，放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易變質(zhì)，防脫片效果會(huì)減弱。

從對(duì)四種病理制片中常用的防脫片劑的比較研究，我們認(rèn)為鉻明礬-明膠是不脫鈣骨切片最理想的防脫片劑，且使用經(jīng)改進(jìn)后的玻片處理方法，可以得到良好的染色效果。

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