多胚苧麻的誘導(dǎo)及多胚性遺傳分析

溫 嵐，喻春明，王延周，陳 平，陳繼康，譚龍濤，熊和平

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410205）

多胚作為一種特殊的生殖現(xiàn)象，對(duì)育種工作有著重要的意義[1]。苧麻的多胚現(xiàn)象于上世紀(jì)得到了證實(shí)[2]，獲得多胚率高且穩(wěn)定的品系是將多胚應(yīng)用于育種的基礎(chǔ)，也是研究作物多胚來(lái)源和機(jī)制的必要條件，經(jīng)過(guò)育種工作者的努力，目前已經(jīng)有不少作物被成功的誘導(dǎo)出用于研究多胚特性的品系。水稻是其中最成功的作物之一，其多胚品系已達(dá)數(shù)十個(gè)，以API-APIV為代表的材料多胚率最高達(dá)32.4%[3-5]。亞麻的多胚材料已經(jīng)育成，并成功應(yīng)用于雜種優(yōu)勢(shì)的固定和轉(zhuǎn)基因育種[6-7]。經(jīng)過(guò)幾代育種工作者的努力，吉甜系列的多胚甜菜品種已達(dá)17個(gè)[8]。此外，延遲授粉已經(jīng)成功應(yīng)用于提高小麥多胚率[9-10]。近年來(lái)，本課題組加快了對(duì)苧麻多胚品系選育的研究，從近200個(gè)地方品種中初步篩選出15個(gè)多胚率高的地方品種，為了將多胚性加以穩(wěn)定和延續(xù)，亟需創(chuàng)造新的高頻多胚種質(zhì)，并探明多胚遺傳的機(jī)制。

被子植物多胚遺傳機(jī)制已有比較詳細(xì)的研究[11-14]，苧麻多胚性的遺傳特性研究目前未見報(bào)道，為初步探索苧麻多胚的遺傳特性，本試驗(yàn)首先對(duì)不同來(lái)源苧麻進(jìn)行雜交和自交，獲得多胚品系的同時(shí)，分析遺傳特性；按照親本選配的互補(bǔ)原則，選擇多胚率差異明顯的材料，設(shè)計(jì)兩組正反交試驗(yàn)，分析后代多胚率差異的顯著性。本研究通過(guò)延遲不同時(shí)間對(duì)苧麻授粉后分別測(cè)定多胚率，初步揭示延遲授粉對(duì)苧麻多胚率的影響。

1 材料和方法

1.1 多胚率的統(tǒng)計(jì)

在人工氣候條件下進(jìn)行紙床催芽，具體方法是：28℃濕潤(rùn)紙床（滅菌）催芽，1cm2擺放1粒種子，5d后進(jìn)行觀察，每個(gè)品種隨機(jī)擺放1000粒種子，重復(fù)三次統(tǒng)計(jì)多胚率。多胚率=多胚種/發(fā)芽種

1.2 高頻率多胚苧麻的誘導(dǎo)

在資源圃選擇多胚率高或產(chǎn)量高的健康植株廣泛雜交和自交，收獲其后代測(cè)定多胚率。

1.3 正反交試驗(yàn)

第I組以中苧2號(hào)為親本，分別與玉山麻等13個(gè)地方品種（系）正反交。

第II組以中苧1號(hào)為親本，分別與靖西青麻等8個(gè)地方品種（系）正反交。

表1 雜交子代多胚率Table 1 The frequencies ofpolyembryonic seeds offilial generations

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

同母本或同父本均值比較采用單樣本t檢驗(yàn)；自交后代與親本間均值比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；正反交結(jié)果之間均值比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。

1.5 延遲授粉

以中苧2號(hào)為母本，開花前2～3天嚴(yán)格去雄后套袋，分別延遲1天、3天、5天和7天授以成熟期中苧1號(hào)花粉，與對(duì)照（不延遲）比較發(fā)芽率及多胚率。

2 結(jié)果和分析

2.1 雜交和自交F1代多胚率的檢測(cè)

選擇資源圃中長(zhǎng)勢(shì)最好的雜交材料或地方品系，設(shè)計(jì)近60組雜交組合，從33個(gè)組合（表1）收獲了較多的種子，其中3組能產(chǎn)生較高多胚率，分別是：Z0663-1×中苧2號(hào)多胚率為9.3‰，Z0663-2×中苧2號(hào)多胚率8.9‰，Z0815×Z0814多胚率為7.8‰。

經(jīng)過(guò)分析雜交組合所得后代的雙胚率可發(fā)現(xiàn)以下規(guī)律：1、以T01-T08為親本的雜交后代均無(wú)多胚現(xiàn)象；2、同母本雜交后代的雙胚率十分接近，如中苧2號(hào)為母本的雜交后代多胚率都非常低，均接近0.5‰。3、同父本雜交后代的多胚率差異大，如Z0805為父本的雜交后代中，雙胚率最高達(dá)3.68‰，最低只有0.27‰。

表2 自交后代多胚率Table 2 The frequencies ofpolyembryonic seeds ofinbred generations

21個(gè)自交種中，除S0811和S0813外，其余多胚率普遍極低(表2)。子代多胚率高于5‰的為S0922和S0924，多胚率分別為5.3‰和6.2‰,親本分別是S0811和S0813。對(duì)親本多胚率與子代多胚率進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，所得P值為0.221，大于0.1，表明兩樣本均值無(wú)差異，部分材料的多胚率在親代和子代中出現(xiàn)差異，為外部環(huán)境影響造成。

2.2 正反交差異的t檢驗(yàn)

表3 正反交后代多胚率Table 3 The frequencies ofpolyembryonic seeds ofreciprocal crossed generations

從表3可以看出：1、沅江肉麻×中苧2號(hào)、圓葉青5號(hào)×中苧2號(hào)和靖西青麻×中苧1號(hào)的子代多胚率均高于5‰，其中多胚率最高的雜交組合為靖西青麻×中苧1號(hào)，多胚率高達(dá)8.5‰；2、兩組多父本試驗(yàn)中，后代多胚率均值經(jīng)t檢驗(yàn)，P值分別為1.0和0.18，表明多父本產(chǎn)生后代的多胚率無(wú)顯著差異；而兩組多母本試驗(yàn)中，后代多胚率均值經(jīng)t檢驗(yàn)，P值分別為0和0.019，表明多母本產(chǎn)生后代的多胚率呈極顯著差異；3、試驗(yàn)組I中正交后代與反交后代多胚率均值進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P值為0，表明正反交后代多胚率呈極顯著差異；試驗(yàn)組II中正交后代與反交后代多胚率均值進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P值為0.015，在差異顯著性0.05水平上，兩者呈顯著性差異。

圖1 延遲雜交授粉對(duì)苧麻多胚誘發(fā)的作用Fig.1 Function of delayedpollination in inducing polyembryonic ramie seeds

圖2 苧麻延遲授粉產(chǎn)生雙胚苗Fig2 Twin-embryoramie seedlings induced bydelayed pollination

2.3 延遲雜交授粉對(duì)多胚率的影響

對(duì)中苧2號(hào)分時(shí)段延遲授粉后，發(fā)芽率和多胚率的變化如圖1所示。在開花期雜交產(chǎn)生子代的發(fā)芽率為99.5%，多胚率與開放授粉的母本多胚率一致，表明人工處理對(duì)子房發(fā)育和受精過(guò)程無(wú)影響。延遲1天授粉，發(fā)芽率有所降低，由99.5%降至94.5%，多胚率無(wú)變化；延遲3天授粉，發(fā)芽率急劇下降至46.8%，但是可育種中多胚率卻明顯提高，由1.3‰提高至3.7‰，提高近3倍；延遲5天授粉，發(fā)芽率降至26.6%，延遲7天授粉發(fā)芽率為零。延遲授粉時(shí)間超過(guò)5天時(shí)，多胚率為零。圖2為延遲3天授粉產(chǎn)生的雙胚苗。

3 討論

3.1 多胚遺傳的特點(diǎn)及其對(duì)苧麻單倍體育種的意義

多胚現(xiàn)象在苧麻中廣泛存在，從苧麻品種間進(jìn)行雜交和的正反交試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，多胚遺傳呈現(xiàn)明顯的胞質(zhì)效應(yīng)。證據(jù)一，同一母本的雜交后代多胚率相同，而同一父本的雜交后代差異很大，多胚表現(xiàn)為母性遺傳；證據(jù)二，正反交的結(jié)果呈現(xiàn)顯著差異或極顯著差異。這兩點(diǎn)都能證明苧麻多胚遺傳的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)。其他作物也有表明多胚屬于胞質(zhì)遺傳，朱建清等對(duì)水稻多胚性遺傳特點(diǎn)進(jìn)行了研究，確定了水稻多胚性遺傳的胞質(zhì)效應(yīng)，效應(yīng)的大小與遺傳背景有關(guān)[4,9,15-17]。

胞質(zhì)遺傳又稱細(xì)胞質(zhì)遺傳，是指正常細(xì)胞質(zhì)成分引起的遺傳現(xiàn)象。廣義的講，細(xì)胞質(zhì)遺傳可以包括染色體遺傳以外的任何細(xì)胞成分，如質(zhì)體、線粒體等所引起的一切遺傳現(xiàn)象，甚至由外來(lái)物質(zhì)引起的遺傳現(xiàn)象也包括在內(nèi)。很多地方都用非染色體遺傳這一概念來(lái)代替細(xì)胞質(zhì)遺傳這一較嚴(yán)格的定義。瑟伯（Serb）等1965年曾經(jīng)例舉出一系列鑒別細(xì)胞質(zhì)遺傳的標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為如果在試驗(yàn)中出現(xiàn)以下任何一種情形，就值得考慮有關(guān)的性狀是屬于細(xì)胞質(zhì)遺傳的：1、正交與反交的結(jié)果不同；2、表現(xiàn)母性遺傳；3、不能在某一特定的染色體上找到相應(yīng)的基因位點(diǎn)；4、兩親雜交后，子代自交或與親本回交表現(xiàn)不分離現(xiàn)象；5、不遵循孟德爾分離定律；6、通過(guò)回交將母本的細(xì)胞核置換后，仍然表現(xiàn)母本性狀[18]。按照這一標(biāo)準(zhǔn)，苧麻多胚性的遺傳符合兩項(xiàng)，因此我們確定苧麻多胚性屬于胞質(zhì)遺傳。

細(xì)胞質(zhì)遺傳效應(yīng)在育種中的應(yīng)用首推雄性不育，培育理想的不育系。其次是核質(zhì)互作，由于異源細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的相互作用，常常產(chǎn)生一些異常特性，在這些特性中，對(duì)本研究而言最有意義的價(jià)值在于單倍體多發(fā)系統(tǒng)的利用。所謂單倍體多發(fā)系統(tǒng)是指通過(guò)將異源細(xì)胞質(zhì)導(dǎo)入含有特定細(xì)胞核的細(xì)胞中，利用這種核質(zhì)互作效應(yīng)，可產(chǎn)生高頻率的單倍體后代。這一特點(diǎn)在小麥單倍體育種中應(yīng)用的最成功，研究者發(fā)現(xiàn)異源細(xì)胞質(zhì)對(duì)染色體行為的影響，首先表現(xiàn)為遠(yuǎn)緣雜種染色體組的消失，如小麥與球莖大麥雜交時(shí)F1染色體組消失產(chǎn)生單倍體，這是由于原生質(zhì)體融合產(chǎn)生的體細(xì)胞雜種出現(xiàn)染色體丟失而產(chǎn)生[19]。其次，異源細(xì)胞質(zhì)直接誘導(dǎo)雜種產(chǎn)生單倍體，Kihara和Tsunewaki首次發(fā)現(xiàn)將普通小麥Salmon（1BL/1RS易位系）導(dǎo)入Ae.caudata細(xì)胞質(zhì)時(shí)，核質(zhì)雜交后代能產(chǎn)生約30%的單倍體及11%的雙胚苗。此后一系列研究證明：C、Cu、Mu等七種類型細(xì)胞質(zhì)的Salmon均能誘導(dǎo)單倍體和n-2n型雙胚苗，這是由于1RS易位短臂上有一個(gè)誘導(dǎo)孤雌生殖的基因Ptg，Ptg基因與該類型細(xì)胞質(zhì)互作能導(dǎo)致卵細(xì)胞獨(dú)立成胚而產(chǎn)生單倍體[20]。

本研究的主要目的是獲得單倍體植株，目前的方法是在多胚苗中篩選，隨機(jī)性較大，該試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)苧麻多胚具有胞質(zhì)遺傳效應(yīng)。首先，對(duì)苧麻多胚育種具有重要意義，因?yàn)榘|(zhì)遺傳的最大特點(diǎn)之一是穩(wěn)定性，我們可以直接利用高頻率多胚品系作為親本，這就縮小了育種材料選擇范圍；更重大的意義是有望開發(fā)苧麻的單倍體多發(fā)系統(tǒng)，尋找類似誘導(dǎo)小麥孤雌生殖的基因，以及能與其發(fā)生核質(zhì)互作效應(yīng)的胞質(zhì)類型，誘發(fā)卵細(xì)胞成胚，最終培育出n-2n型多胚品種。

3.2 延遲授粉對(duì)多胚誘導(dǎo)的作用

一般而言開花期柱頭受精能力最強(qiáng)，此時(shí)的柱頭色澤鮮明，如果在這時(shí)授粉，結(jié)實(shí)率最高。授粉時(shí)間和受精時(shí)的條件對(duì)延遲授粉的結(jié)果有很大影響，不同作物具有受精能力的期限不同，禾谷類作物柱頭在開花期1-2天即有受精能力，棉花柱頭的受精能力只能維持到開花第二天，大豆則可維持2-3天。苧麻柱頭的受精能力維持時(shí)間的研究尚未見報(bào)道,本試驗(yàn)對(duì)苧麻延遲授粉試驗(yàn)表明，中苧1號(hào)柱頭受精能力維持的時(shí)間小于7天。

延遲授粉已被證明對(duì)小麥、天麻多胚發(fā)生具有促進(jìn)作用，在天麻開花授粉的單果內(nèi)，多胚率不超過(guò)1%，然而當(dāng)授粉延遲3-4天時(shí)，單果內(nèi)多胚種子的數(shù)目有顯著增加，表明延遲授粉是有助于多胚形成的。延遲授粉天數(shù)對(duì)誘導(dǎo)效果影響最明顯，用黑麥和硬粒小麥給普通小麥品種間雜種F1授粉，發(fā)現(xiàn)去雄后8天授粉誘導(dǎo)多胚效果最好[21-22]。本試驗(yàn)首次通過(guò)種間延遲授粉獲得了高于對(duì)照2倍的多胚率，對(duì)多胚誘導(dǎo)提供了一條新的途徑。今后將采用延遲授粉對(duì)不同品種多胚誘導(dǎo)的效果進(jìn)行研究，并通過(guò)胚胎學(xué)手段觀察去雄后成熟胚囊的變化，以探明延遲授粉誘導(dǎo)多胚形成的機(jī)制。

[1] 黃群策.被子植物多胚苗的研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào)，1998，15（2）：1-7.

[2] 熊和平.苧麻雙胚苗的培育和獲得[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1991，24（2）：90-92.

[3] Zhang HY,Peng H,Wu SH,Huang J,Wu xj.cDNA-AFLP analysis among different organs of haploid and diploid plants in twin-seedlingrice[J].Yi Chuan,2009,31(3):305-310.

[4] 朱建請(qǐng),周開達(dá),田玉泉.水稻多胚性遺傳研究[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1995,13(4):475-478.

[5] 黃群策,孫敬三.多胚苗水稻APIV不同穎花的多卵和多胚苗頻率研究[J].植物學(xué)通報(bào),1999,16(3):280-283.

[6] 康慶華.雙胚亞麻（Linum usitatissmum L.）利用的研究[J].中國(guó)麻業(yè)，2004，26（3）：110-113.

[7] 康慶華,許修宏，張利國(guó)等.亞麻單倍體抗逆基因的轉(zhuǎn)化[J].中國(guó)麻業(yè)科學(xué)，2006，28（6）：291-293.

[8] 王華忠,張文彬,李彥麗.甜菜多胚保持系在單胚雄性不育系改良中的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1995,28（6）：90-92.

[9] Lapchenko G D,Bovkis E N．Polyembryony in wheat--agropyron hybrids(2n equal 42)and(2n equal 56)[J]．Sov Genet，1973,7(7)：838-842．

[10] Pershina L A，Belova L I，Deviatkina E P，et al．Features of crossability,haploidy and polyembryony in hybrid combinations between common barley Hordeum vulgare L．(2n=14)and wheat-rye substitution lines Triticum aestivum L，cultivar Saratovskaya 29/Secale cereale L，cultivar Onokhoiskaya][J]．Genetika，2005，41(6)：784-792．

[11]Mendes-Rodrigues C,Carmo-Oliveira RTalavera S，et al．Polyembryonyand apomixis in Eriotheca pubescens(Malvaceae-Bombacoideae)[J]．Plant Biol(Stuttg)，2005,7(5)：533-540．

[12]Maluszynski M．Doubled haploid production in crop plants:a manual[M]．Dordrecht：Kluwer Academic Publishers．2003，12（03）：428．

[13] Longin CF，UtzH F，ReifJ C，et al．Hybrid maize breedingwith doubled haploids：III．Efficiencyofearlytestingprior todoubled haploid production in two-stage selection for testcross performance[J]．Theor Appl Genet．2007，115(4)：519-527．

[14]KoltunowAM,Hidaka T,Robinson S P．Polyembryonyin Citrus．Accumulation of seed storage proteins in seeds and in embryos cultured in vitro[J]．Plant Physiol．1996，110(2)：599-609．

[15] 劉向東，盧永根，陳啟鋒.多胚水稻品系A(chǔ)PIV多卵遺傳行為分析[J].遺傳,1996,18(5):7-10.

[16] 張紅宇.吳先軍.雙胚苗水稻中單倍體和二倍體不同器官的cDNA-AFLP分析[J].遺傳，2009,03（19）：79-84.

[17] 邢少辰,周開達(dá),蔡玉紅.水稻及其它植物中多胚苗的研究進(jìn)展[J].張家口農(nóng)專學(xué)報(bào).2000,16(2):43-46.

[18] 華北農(nóng)業(yè)大學(xué)，中科院遺傳研究所，廣東農(nóng)林學(xué)院.植物遺傳育種學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社.2009：409-411.

[19] 劉娜，趙昌平.小麥孤雌生殖育種技術(shù)研究新進(jìn)展[J].種子,2007,26(3):47-50.

[20] 馮海生，陳集賢，陳志國(guó)．麥類作物多胚的研究III高原602雙胚苗的細(xì)胞學(xué)類型[J].西北植物學(xué)報(bào)，1999,19(4):669-672.

[21] 苗芳,董安書，曹翠玲.異屬花粉誘導(dǎo)小麥孤雌生殖的假受精研究[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，3（18）：98-101.

[22] 賈敬鶯，胡啟德，袁淑安.遠(yuǎn)緣花粉延遲授粉誘導(dǎo)小麥單性生殖的染色體觀察[J].遺傳，1992，14（6）：26-27.