2種左甲狀腺素鈉片的人體生物等效性研究

王蒙，周文佳，黃明，張全英（蘇州大學附屬第二醫(yī)院藥劑科，蘇州市 215004）

左甲狀腺素鈉（Levothyroxine sodium，L-T4）是一種合成的甲狀腺素鈉，與甲狀腺素（T4）作用相同。L-T4可作為替代或補充治療不同的病因引起的先天性或獲得性甲狀腺功能減退癥，其可用于亞臨床甲狀腺功能減退和初期（甲狀腺）、二期（垂體）和三期（下丘腦）甲狀腺功能減退患者的治療。L-T450%～80%是通過胃腸道吸收，空腹口服后，達峰時間為6 h，之后血漿L-T4濃度不斷下降。由于L-T4較之三碘甲腺原氨酸（T3），與蛋白結(jié)合率更高，結(jié)合更牢固，故一般3～5 d才起作用。大多L-T4代謝發(fā)生在周圍器官，經(jīng)過在肝、腎及其他組織中部分脫碘轉(zhuǎn)化為T3和反三碘甲狀腺原氨酸（rT3）。T4和T3的血漿半衰期分別為6～7 d和1～2 d。L-T4是一個治療指數(shù)窄的藥物，同時血液中自然存在少量的L-T4。在本試驗的設(shè)計及生物等效性評價中，參照了美國食品與藥物管理局（FDA）發(fā)布的關(guān)于以左甲狀腺素鈉為例的體內(nèi)藥動學、生物利用度研究和體外溶出試驗指導原則[1]，以便保證這類窄治療窗藥物的生物等效的確與治療學上的等效是一致的。德國柏林化學股份有限公司生產(chǎn)的L-T4（商品名:雷替斯?）已在中國上市，由于某些患者不耐受乳糖或?qū)χ珓┻^敏，該公司研制出Berlthyrox?，該片劑不含乳糖和著色劑，已在德國上市，為申請在中國進口注冊，現(xiàn)以雷替斯?為參比制劑，對Berlthyrox?進行人體相對生物利用度研究，以評價2種制劑是否具有生物等效性，為新藥申報和臨床合理應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

SN-695B型智能放射免疫γ測量儀（上海核所日環(huán)光電儀器有限公司）；DK-600A型電熱恒溫水箱（上海一恒科技有限公司）；KDC-2044低速冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；Vortex genie 2渦旋振蕩器（美國Scientific industries公司）；MODELYB DH-1低恒壓吸引器（上海醫(yī)療器械工業(yè)（集團）公司醫(yī)用吸引器廠）；411分液器（瑞士Socorex公司）；DAS 2.0數(shù)據(jù)處理軟件（皖南醫(yī)學院）。

1.2 試藥

受試制劑:（Berlthyrox?，德國柏林化學股份有限公司，規(guī)格:每片含L-T4100 μg，不含乳糖，批號:84105）；參比制劑:（雷替斯?，德國柏林化學股份有限公司，規(guī)格:每片含L-T4100 μg，含乳糖，批號:84034）；T4放射免疫分析藥盒（北京北方生物技術(shù)研究所，批準文號:國藥準字S10930048，批號:20090920、20091020、20091120）；T3放射免疫分析藥盒（北京北方生物技術(shù)研究所，批準文號:國藥準字S10930047，批號:20090920、20091020、20091120）；T4、T3質(zhì)控血清（中國藥品生物制品檢定所，批號:1601-0812）；水為注射用水（安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 受試者選擇

26名健康志愿者，男女各半，平均年齡（23±2）歲，平均身高（165.2±8.6）cm，平均體重（57.8±7.4）kg。試驗前，試驗方案和知情同意書經(jīng)蘇州大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會審批同意后，受試者簽署知情同意書，經(jīng)病史詢問，并均進行常規(guī)體檢和十二導聯(lián)心電圖、實驗室檢查（血常規(guī)、凝血功能、尿常規(guī)、血生化、病毒學）、甲狀腺功能全套（T3、fT3、T4、fT4、TSH）檢查，合格者入選為受試者。

2.2 試驗方案[1]

26名受試者隨機分成2組，每組12人，按2×2交叉試驗方案設(shè)計，分別口服參比制劑或受試制劑6片（各含L-T4600 μg），藥物經(jīng)清除35 d后交換給藥。受試者禁食過夜10 h，用240 mL溫開水送服。所有受試者在給藥后1 h內(nèi)禁水，4 h內(nèi)禁食。分別于給藥前0.5、0.25、0 h及給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、12、18、24、48 h時由前臂靜脈采血4 mL，置分離膠離心試管中，靜置30～60 min，離心（4 ℃，3500 r·min－1）5 min，分離血清于－70℃冷凍保存。

2.3 血清樣品處理

按藥盒說明書操作。T4:取樣品或標準品50 μL加入試管中，再依次加入125I-T4200 μL和羊抗-T4抗體100 μL，混勻后37℃水浴孵育45 min，加入T3、T4驢抗羊免疫分離劑500 μL，混勻后室溫放置15 min，于4 ℃以3500 r·min－1離心15 min，吸棄上清液，沉淀物用SN-695B型智能放射免疫γ測量儀測定。T3:取樣品或標準品50 μL加入試管中，再依次加入125I-T3200 μL和羊抗-T3抗體100 μL，混勻后37℃水浴孵育1 h，加入T3、T4驢抗羊免疫分離劑500 μL，同上離心、測定。制備標準曲線和分析樣品時均采用雙復(fù)管。

2.4 標準曲線的制備

精密移取水500 μL分別溶解T4標準品滅菌粉末，靜置15 min后，渦旋混勻，得到標準血清樣品的濃度分別為20.00、40.00、80.00、160.00、320.00 ng·mL－1，用放射免疫分析法測定各管的放射性每分鐘記數(shù)（counts per minute，cpm），通過logit-log方法進行數(shù)據(jù)處理，得直線回歸方程為:y＝5.3810－1.2099x（r＝－0.99856），線性范圍20.00～320.00 ng·mL－1。另同法溶解T3標準品滅菌粉末，得到標準血清樣品的濃度分別為0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 ng·mL－1，并同法測定，得直線回歸方程為:y＝0.8530－1.0846x（r＝－0.99859），線性范圍0.50～8.00 ng·mL－1。

2.5 方法靈敏度

以20管不含T4、T3的血清的cpm數(shù)的均值－2×標準差計算方法靈敏度，得T4、T3藥盒靈敏度分別為3.19 ng·mL－1和0.02 ng·mL－1。

2.6 精密度及回收率試驗

分別配制T4低、中、高（30.80、77.40、124.00 ng·mL－1）及T3低、中、高（0.81、1.92、3.03 ng·mL－1）3種濃度的質(zhì)控血清樣品，于不同天內(nèi)各測定3批，計算方法回收率和日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果見表1。

表1 精密度及回收率試驗結(jié)果Tab 1 Results of precision and recovery tests

2.7 穩(wěn)定性試驗

分別配制T4低、中、高（30.80、77.40、124.00 ng·mL－1）3種濃度的質(zhì)控血清樣品，分別在室溫放置6 h、反復(fù)凍融（1、2、3次）和－70℃保存58 d條件下測定；另分別配制T3低、中、高（0.81、1.92、3.03 ng·mL－1）3種濃度的質(zhì)控血清樣品，同法測定。結(jié)果RSD均＜15%。

2.8 藥-時曲線

26名受試者單劑量口服L-T4片受試制劑或參比制劑后T4、T3的平均藥-時曲線見圖1。

2.9 藥動學參數(shù)和生物等效性

26名受試者單劑量口服L-T4受試制劑或參比制劑6片后，T4、T3主要藥動學參數(shù)見表2。

受試者交叉口服2種制劑后，cmax經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行方差分析結(jié)果表明，T3制劑、周期、個體間無顯著性差異，T4制劑、周期、個體間均有顯著性差異。AUC0～48h經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行方差分析結(jié)果表明，除T3制劑周期間無顯著性差異外，其余均有顯著性差異。按生物等效性判定標準，AUC0～48h和cmax90%置信區(qū)間均在80%～125%內(nèi)，認為2種制劑生物等效。與參比制劑相比，受試制劑T4的相對生物利用度為（95.9±11.6）%，T3的相對生物利用度為（99.2±12.6）%，表明2種制劑生物等效。tmax經(jīng)Wilcoxon檢驗差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。T4和T3生物等效性分析結(jié)果見表3。

3 討論

文獻[2]的等效性判定標準:經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換的受試制劑的AUC0～48h在參比制劑的80%～125%范圍內(nèi)，受試制劑的cmax在參比制劑的70%～143%范圍內(nèi)[2]。由于L-T4是一個治療窗窄的藥物，為了嚴格增加治療學上等效性和可替代性，筆者采用了美國FDA等效性判定標準，即受試制劑的AUC0～48h、cmax與參比制劑AUC0～48h、cmax的比值的90%置信區(qū)間在80%～125%范圍內(nèi)[1]。

表2 26名受試者單劑量口服L-T4片受試制劑或參比制劑6片后的T4和T3藥動學參數(shù)Tab 2 Pharmacokinetic parameters of levothyroxine sodium in 26 healthy volunteers for T4 and T3 after oral administration of Levothyroxine sodium tablets

表3 T4和T3生物等效性分析結(jié)果Tab 3 Results of bioequivalence analysis for T4 and T3

26位受試者（男、女各半）單劑量、隨機、開放、雙周期交叉口服L-T4片受試制劑和參比制劑后，血清中T4呈明顯時量變化，受試制劑和參比制劑的主要藥動學參數(shù)均與國內(nèi)、外文獻報道[3～5]基本一致。血清中T3無明顯時量變化。血清中T4、T3的AUC0～48h、cmax90%置信區(qū)間均在80%～125%范圍內(nèi)。表明2種制劑生物等效。

受試者lncmax方差分析結(jié)果表明T3制劑、周期、個體間無顯著性差異，T4制劑、周期、個體間均有顯著性差異。lnAUC0～48h方差分析結(jié)果表明，除T3制劑周期間無顯著性差異外，其余均有顯著性差異。推測原因可能如下:每位受試者體內(nèi)不同時間的甲狀腺激素基線值水平是不同的，由此可能產(chǎn)生給藥后個體間的顯著性差異。甲狀腺激素基線值水平受機體各器官、系統(tǒng)之間相互協(xié)調(diào)、相互制約，由此可能產(chǎn)生給藥后周期間和制劑間的差異，提示臨床要注意個體化給藥。

[1]US Dept of Health and Human Services，F(xiàn)ood and Drug Administration，Center for Drug Evaluation and Reserch.Guidance for Industry:Levothyroxine sodium tablets in vivo pharmacokinetic and bioavailability studies and in vitro dissolution testing[EB/OL].http://www.Fda.gov/cder/guidance/3645fnl.htm.2004-10-07.

[2]國家食品藥品監(jiān)督管理局.化學藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導原則[EB/OL].http://www.doc88.com/p-30190808136.html.2005-03.

[3]朱 立，趙志英，王正華.國產(chǎn)左甲狀腺素鈉片劑生物利用度研究[J].中國臨床藥理學雜志，2001，17（6）:440.

[4]榮征星，趙詠桔，陳廣潔，等.左甲狀腺素2種配方片劑人體生物利用度比較[J].中國新藥與臨床雜志，2005，24（1）:7.

[5]Di Girolamo G，Keller GA，de Los Santos AR，et al.Bioequivalence of two levothyroxine tablet formulations without and with mathematical adjustment for basal thyroxine levels in healthy Argentinian volunteers:a single-dose，randomized，open-label，crossover study[J].Clin Ther，2008，30（11）:2015.