HPLC法測定人血漿中帕羅西汀的濃度

劉廣軍，杜貫濤，成金羅（南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院，常州市 213003）

鹽酸帕羅西?。≒aroxetine hydrochloride）化學(xué)名為:（－）-反式4-（4-氟苯基）-3{[3，4（甲二氧基）苯氧基]甲基}哌啶鹽酸鹽，是一種選擇性5-羥色胺（5-TH）再攝取抑制劑（Selective serotonin reuptake inhibitor，SSRIs），其通過選擇性地抑制神經(jīng)元突觸對5-HT的再攝取，使突觸間隙5-HT濃度增加，促進傳遞功能，從而發(fā)揮治療抑郁癥、強迫癥及驚恐癥等精神疾病的作用。與傳統(tǒng)的三環(huán)類抗抑郁藥相比，SSRIs毒副作用較小，患者耐受性好，其治療費用少，因此在臨床上受到越來越廣泛的應(yīng)用[1～3]。為方便對帕羅西汀血藥濃度的監(jiān)測和藥動學(xué)的研究。筆者利用現(xiàn)有的試驗條件，建立了一種簡便、快速、靈敏的測定人血漿中帕羅西汀濃度的高效液相色譜法。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀，包括Waters 2695泵、2487紫外檢測器、Empower 2工作站（美國Waters公司）；T6型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；N-EVAP氮吹儀（美國Organomation公司）；Allegra.TM.21R型臺式冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；Milli-Q純水機（美國Millipore公司）；XH-C型渦旋混合器（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.2 試藥

帕羅西汀標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號:100065-200505）；內(nèi)標(biāo):鹽酸舍曲林標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號:100702-200401）；乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、磷酸均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Phenomenex ODS 預(yù)柱（4 mm×3 mm）；流動相:0.05 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液（pH 3.5）-乙腈（62.5∶37.5）；檢測波長:205 nm；流速:1 mL·min－1；柱溫:35 ℃；進樣量:40 μL。在該色譜條件下，鹽酸帕羅西汀、鹽酸舍曲林能夠與雜質(zhì)峰完全分離，色譜峰形良好，保留時間分別為6.3、10.2 min，血漿中雜質(zhì)對測定不產(chǎn)生干擾。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.帕羅西汀標(biāo)準(zhǔn)溶液+內(nèi)標(biāo)溶液；C.患者服藥后血樣；1.鹽酸帕羅西汀；2.鹽酸舍曲林Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.paroxetine standard substance+internal standard；C.blood sample of patients after administration；1.paroxetine hydrochloride；2.sertraline hydrochloride

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取鹽酸帕羅西汀標(biāo)準(zhǔn)品及鹽酸舍曲林標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別配制成濃度為400 μg·mL－1和200 μg·mL－1的甲醇溶液作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液和內(nèi)標(biāo)溶液，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品的處理

精密吸取1 mL血漿于10 mL離心管內(nèi)，加入稀釋成4 μg·mL－1的鹽酸舍曲林內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，渦旋混勻15 s，加甲醇0.5 mL后渦旋1 min，4500 r·min－1離心10 min，取上清液移入另一10 mL離心管中，加入0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液 0.2 mL，渦旋30 s后加入正己烷5 mL渦旋2 min，4500 r·min－1離心10 min，取上清液4 mL于10 mL尖底試管內(nèi)，40℃水浴中氮氣流吹干，殘渣用100 μL流動相溶解，取40 μL進行高效液相色譜測定。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

于健康人空白血漿中加入不同量的鹽酸帕羅西汀貯備液并進行系列稀釋，使最后的血漿濃度分別為0.00781、0.0156、0.0313、0.0625、0.125、0.25、0.5 μg·mL－1，然后按“2.3”項下方法操作，記錄色譜。采用1/Y2權(quán)重以藥物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（Y）對標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（X）加權(quán)回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y＝1.795X－0.0019（r＝0.9994）。結(jié)果表明，鹽酸帕羅西汀血藥濃度在0.00781～0.5μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；帕羅西汀的最低定量限為0.2 μg·mL－1。

2.5 回收率及精密度試驗

2.5.1 方法回收率:于健康人空白血漿中加入不同量的鹽酸帕羅西汀貯備液并進行系列稀釋，使最后的血漿濃度分別為0.00781、0.0625、0.5 μg·mL－1，按“2.3”項下方法操作，記錄帕羅西汀與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（Y），代入回歸方程，計算方法回收率（以測得量與加入量的比值計算回收率），結(jié)果見表1。

表1 回收率及精密度試驗結(jié)果（n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision tests（n＝5）

2.5.2 萃取回收率:按“2.5.1”項下方法配制成高、中、低3種濃度的血漿樣品，按“2.3”項下方法操作，記錄帕羅西汀峰面積As；另用流動相制備鹽酸帕羅西汀標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度分別為0.00781、0.0625、0.5 μg·mL－1），進樣并記錄峰面積Ai，以As/Ai計算萃取回收率，結(jié)果見表1。

2.5.3 精密度試驗:按“2.5.1”項下方法配制成高、中、低3種濃度的血漿樣品，按“2.3”項下方法操作，記錄帕羅西汀峰面積與內(nèi)標(biāo)峰峰面積的比值，分別考察在同日內(nèi)和5 d內(nèi)的精密度，結(jié)果見表1。

2.6 穩(wěn)定性試驗

按“2.5.1”項下方法配制成高、中、低3種濃度的血漿樣品作為質(zhì)控樣品，以進行穩(wěn)定性考察。對樣品室溫放置0、4、8、24 h，冰箱冷藏5 d后，反復(fù)凍融3次后測定，結(jié)果帕羅西汀RSD均＜5%，表明未發(fā)生明顯降解。

2.7 測定實例

5例患者口服帕羅西汀1周后，使用劑量為每日10 mg，達穩(wěn)態(tài)后取血，使用本方法處理并測得其血藥濃度分別為9.08、19.36、8.11、7.34、29.60 ng·mL－1，說明本測定方法可行。

3 討論

在選擇內(nèi)標(biāo)時，筆者同時考察了苯妥英鈉、卡馬西平、地西泮、舍曲林等多個藥物，經(jīng)綜合考慮內(nèi)標(biāo)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、吸收曲線等因素后，最終確定以舍曲林為內(nèi)標(biāo)，二者分離度良好且能夠與雜質(zhì)峰分離，系統(tǒng)理論板數(shù)較高。

文獻常用萃取方法多用有機溶劑直接提取，本試驗參考了相關(guān)文獻[4～6]，試用了多種有機溶劑提取血樣中的帕羅西汀，分別考察了醋酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、正庚烷、正己烷等。研究發(fā)現(xiàn)，用有機溶劑直接提取后，雜質(zhì)較多，進樣后容易堵塞色譜柱，造成柱壓升高，峰形改變等。故本試驗采用先用甲醇沉淀后再用有機溶劑提取法，文中使用正己烷萃取，可以有效減少樣品中雜質(zhì)，提取回收率也較高。試驗也發(fā)現(xiàn)隨濃度的升高，萃取回收率有下降的趨勢，可能與萃取效率下降有一定關(guān)系，與之對應(yīng)的是，方法回收率也有與此類似的趨勢，但是不影響試驗的準(zhǔn)確性。

本試驗通過優(yōu)化流動相，并選擇合適內(nèi)標(biāo)及提取溶劑，對已報道的高效液相色譜法進行了改進，具有操作簡便，雜質(zhì)干擾少，準(zhǔn)確度、靈敏度高等優(yōu)點?？捎糜邴}酸帕羅西汀在人體內(nèi)的血藥濃度測定及藥動學(xué)研究。

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