硅膠柱層析-RP-HPLC法同時測定火麻仁中3種大麻酚類化合物的含量Δ

夏林波，郭瑩，鄧仕任（遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，大連市 116600）

火麻仁又名大麻仁、麻子仁，為?？浦参锎舐镃annabis sativa L.的干燥成熟果實[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是一味亦藥亦食的潤下藥，具有潤燥滑腸、活血之功效，在臨床上廣泛用于治療腸燥便秘、血虛津虧等證。同時，由于其還含有豐富的脂肪油和麻仁球蛋白，具有較高的營養(yǎng)價值，近年來在保健食品領域的應用也日益廣泛[2]。然而，火麻仁有“小毒”，一次性大劑量服用火麻仁（30～60 g）會產(chǎn)生惡心、嘔吐、四肢麻木、昏迷、瞳孔散大等中毒癥狀，這主要與其含有一類對神經(jīng)系統(tǒng)起強烈致幻作用的物質——大麻酚類物質有關[3]。研究表明，火麻仁中含有60余種大麻酚類化合物[3]，但主要成分為以下3種:Δ9-四氫大麻酚、大麻酚和大麻二酚，其中Δ9-四氫大麻酚對中樞神經(jīng)的作用最強，且能與另2種成分進行相互轉化。因此，嚴格控制火麻仁中該3種成分的含量具有重要意義。

到目前為止，對該類成分進行質量控制的研究主要集中在大麻樹脂提取物[4，5]和火麻仁油脂[6，7]上，而對火麻仁整體藥材中大麻酚類化合物的含量測定卻鮮有報道[8]，更未見對該3種主要成分同時進行含量測定的研究。由于火麻仁在臨床使用中都是以整體藥材入藥，因此直接測定整體藥材中大麻酚類物質的含量就顯得尤為重要。此外，由于火麻仁中含有大量油脂[9]，其對大麻酚類成分的測定會造成嚴重的干擾，因此在采用高效液相色譜（HPLC）法進行含量測定之前，必須采用適當?shù)念A處理方法進行樣品的純化。基于上述分析，本試驗通過硅膠柱層析純化技術，結合反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，對火麻仁整體藥材中的3種大麻酚類化合物進行含量測定，以為火麻仁的質量控制與臨床合理安全用藥提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 Series HPLC儀，包括在線真空脫氣機、低壓四元梯度泵、柱溫箱、紫外檢測器、Agilent LC色譜工作站（美國安捷倫科技有限公司）；AR2140電子分析天平（上海力能電子儀器有限公司）；Milli Q純水系統(tǒng)（美國密理博公司）；RE-52CS旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；U-3010紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；舒美KQ2200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率:100 W，工作頻率:40 kHz）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華儀器有限公司）。

大麻二酚（批號:1235-9907）、大麻酚（批號:171234-200809）、Δ9-四氫大麻酚（批號:171236-200609）對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，以甲醇溶解，使成濃度均為1mg·mL-1的對照品溶液；乙腈為色譜純（天津科密歐化學試劑有限公司），水為超純水（18.2 MΩ·cm），其他試劑均為分析純；柱層析硅膠（200～300目，青島海洋化工有限公司）；13批不同產(chǎn)地的火麻仁藥材，均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學鑒定教研室翟延君教授鑒定為?？浦参锎舐镃.sativa L.的干燥成熟果實。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（150mm×4.6mm，5 μm）；流動相:乙腈-水（68∶32）；流速:1.0mL·min-1；檢測波長:220 nm；柱溫:30℃；進樣量:10μL。在此色譜條件下，大麻二酚、大麻酚、Δ9-四氫大麻酚的理論板數(shù)均不低于10000，分離度與拖尾因子均符合含量測定要求。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.未經(jīng)硅膠柱純化的樣品；C.經(jīng)硅膠柱純化的樣品；1.大麻二酚；2.大麻酚；3.Δ9-四氫大麻酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.test sample without purification；C.test sample after purification；1.cannabidiol；2.cannabinol；3.Δ9-tetrahydrocannabinol

2.2 對照品溶液的制備

分別精密吸取適量大麻二酚、大麻酚、Δ9-四氫大麻酚對照品溶液（濃度均為1mg·mL-1），分別轉移至10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成質量濃度均為40μg·mL-1的對照品溶液。

分別精密吸取大麻二酚對照品溶液5mL、大麻酚對照品溶液2.5mL、Δ9-四氫大麻酚對照品溶液2.5mL，轉移至同一10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成質量濃度分別為20、10、10μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取火麻仁藥材粉末（過40目篩）約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100mL，稱定重量，冷浸30min后，超聲振蕩提取30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，過濾，取濾液。殘渣重復提取2次，合并3次濾液后減壓濃縮至近干，殘留物用甲醇溶解并定容至2mL。取硅膠25 g，用適量淋洗劑（氯仿∶石油醚＝4∶1，V/V）調勻后濕法裝入層析柱中，再精密吸取0.5mL火麻仁甲醇溶液上柱，加入淋洗劑洗脫。收集50～100mL段洗脫液，將所得溶液減壓濃縮至干，殘留物用甲醇溶解，轉移至1mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關系考察

精密吸取混合對照品溶液1、5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下進樣分析。以峰面積積分值（Y）對絕對進樣量（X，μg）進行線性回歸，制備標準曲線，得3種活性成分的回歸方程、相關系數(shù)及線性范圍，詳見表1。

表1 線性關系考察結果（n＝6）Tab 1 Result of linear regression examination（n＝6）

2.5 精密度試驗

取同一混合對照品溶液適量，在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄各自峰面積。結果，大麻二酚、大麻酚、Δ9-四氫大麻酚峰面積的RSD分別為2.1%、1.2%和2.4%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一份火麻仁藥材（廣西產(chǎn)）樣品粉末適量，共6份，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣分析，計算含量。結果，大麻二酚、大麻酚、Δ9-四氫大麻酚含量的RSD分別為2.2%、1.0%和2.4%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一火麻仁藥材（廣西產(chǎn)）供試品溶液適量，室溫放置，分別于0、4、8、12、24h進樣分析，記錄各自峰面積。結果，大麻二酚、大麻酚和Δ9-四氫大麻酚峰面積的RSD分別為1.8%、1.2%和2.4%（n＝5），表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的火麻仁藥材（廣西產(chǎn)）粉末6份，每份約2 g，精密稱定，分別精密加入一定量的大麻二酚、大麻酚和Δ9-四氫大麻酚對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣分析，計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Result of recovery experiments（n＝6）

2.9 樣品含量測定

分別稱取不同來源的火麻仁藥材粉末（過40目篩）約10 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣分析，采用外標法以峰面積計算大麻二酚、大麻酚和Δ9-四氫大麻酚的含量，結果見表3。

表3 13批次樣品的含量測定結果（μg·g-1，n＝3）Tab 3 Result of content determination of 13 batches of samples（μg·g-1，n＝3）

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

試驗比較了Agilent XDB-C18、Agilent SB-C18、Agilent SB-C8、Shim-pack VP-ODS 和Dikma Diamonsil-C18等多種固定相系統(tǒng)，以及乙腈-水、乙腈-0.1%醋酸水、甲醇-水和甲醇-0.1%醋酸水等多種流動相系統(tǒng)。結果表明，以Agilent XDB-C18為固定相、乙腈-水為流動相，所得色譜圖分離度較好、基線平穩(wěn)、檢測時間較短。再分別對所測3種成分對照品溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描，結果大麻二酚、大麻酚和Δ9-四氫大麻酚均在220 nm波長處有最大吸收，故在220 nm波長下進行含量檢測。

3.2 樣品提取條件的優(yōu)化

由于大麻酚類化合物受熱易分解，因此本試驗選擇了超聲提取法；并對不同提取溶劑（甲醇、乙醇以及不同比例的甲醇-水、乙醇-水溶液）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15，W/V）、提取時間（15、30、45min）、提取次數(shù)（2、3、4次）等因素進行了考察。結果表明，采用10倍量甲醇超聲3次，每次提取30min，可以將大麻酚類成分提取完全，同時可將提取液中的油脂含量降到最低。

3.3 樣品的純化

由于火麻仁中含有豐富的油脂，因此即使采用甲醇萃取，也很難完全不提取出脂類成分，而脂類成分的存在對于大麻酚類的檢測造成了嚴重的干擾，如圖1 B所示，在油脂成分的干擾下，3種大麻酚類成分幾乎已經(jīng)無法檢出，這主要是由大麻酚類化合物既具有醇溶性，又具有脂溶性的特點造成的。當濃縮后的提取物中含有較多油脂時，加入的少量甲醇并不能使大麻酚類物質充分地從油脂中萃取出來，因而也就無法在HPLC系統(tǒng)中進行有效的檢測。由此可見，在分析測定前必須對樣品進行脫脂處理，以消除脂類成分的干擾，而常用的石油醚或乙醚的脫脂方法必然會造成脂溶性大麻酚類化合物的大量損失，為此本試驗采用了硅膠柱層析的方法對樣品進行純化。

試驗考察了氯仿、乙酸乙酯、石油醚以及不同比例的混合溶劑的純化效果，最終選用氯仿-石油醚（4∶1，V/V）的混合溶劑作為淋洗劑，25 g硅膠濕法裝柱，將所得餾分分段收集，以HPLC監(jiān)測。結果表明，大麻酚類物質完全集中于50～100mL段流出。收集該段餾分，揮干溶劑后已無明顯油狀物，加一定量甲醇溶解，進HPLC檢測，所得色譜圖如圖1C所示?？梢姡?jīng)硅膠柱層析純化后，3種大麻酚類化合物均可順利檢出，且峰形對稱、基線平穩(wěn)，均能達到基線分離（R＞1.5）。

3.4 測定結果分析

從表3可以看出，不同來源的火麻仁中3種大麻酚類成分含量差異較大:來自四川、廣西的火麻仁中大麻二酚的含量較高，而Δ9-四氫大麻酚的含量較低；來自內(nèi)蒙古、河北張家口的火麻仁中Δ9-四氫大麻酚的含量較高。這與Haney等[10]的研究結果相符，該文作者認為可能是由于植物的不同生長環(huán)境造成的。另據(jù)有關資料[11]，大麻可分為纖維型和藥用型2種類型，前者Δ9-四氫大麻酚的含量較低，而后者則含量較高，本試驗測定結果的顯著性差異也有可能受到這種因素的影響。

3.5 限量標準

美國Par Pharmaceutical公司的口服抗嘔吐藥Marinol的有效成分即為Δ9-四氫大麻酚，其對人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不良反應的口服劑量為0.4mg·kg-1（28mg/70 kg）；《中國藥典》中所規(guī)定的火麻仁的使用量為10～15 g，結合火麻仁中Δ9-四氫大麻酚的實際測定結果，初步擬定火麻仁藥材中的主要毒性成分Δ9-四氫大麻酚的含量不得超過10μg·g-1。

4 結論

合理的樣品前處理不僅可以使待測成分有效地檢出，還能夠減少雜質對色譜柱的損害[12]。本試驗通過硅膠柱層析的前處理方法有效地除去了干擾成分，繼而采用RP-HPLC法對13批不同產(chǎn)地的火麻仁藥材中3種具有中樞神經(jīng)活性的大麻酚類化合物（大麻二酚、大麻酚、Δ9-四氫大麻酚）進行了同時測定。本方法操作簡便，結果準確、穩(wěn)定，且重復性好，可為火麻仁的質量控制及臨床合理安全用藥提供參考依據(jù)。

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