固相萃取-HPLC法測定白果中總銀杏酸的含量Δ

羅 曼，鮑家科，宋曉寧，張志勇，張志宇，吳克楠（貴州省藥品檢驗所，貴陽市 550004）

白果為銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba L.的干燥成熟種子，秋季種子成熟時采收，除去肉質(zhì)外種皮，洗凈，稍蒸或略煮后，烘干[1]。白果具有多種生物活性物質(zhì)，銀杏酸是其毒性成分，具有致敏性、胎盤毒性和免疫毒性作用[2～4]，對人類健康有潛在危害，但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中尚未控制白果中銀杏酸的含量。因此，應(yīng)建立準(zhǔn)確的分析方法，對白果及其炮制品中的銀杏酸進(jìn)行控制，為白果及其炮制品的研究提供理論基礎(chǔ)。

固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）是近年發(fā)展起來的一種樣品預(yù)處理技術(shù)，由液-固萃取和柱液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來，由于具萃取效率高、選擇性好、適用范圍廣、操作簡單、省時等優(yōu)點，目前已被較為廣泛地應(yīng)用于環(huán)境分析、食品分析、生物樣本中毒物的分析[5，6]中，在復(fù)雜中藥有效成分分析方面的應(yīng)用也日益增加[7～9]。銀杏酸在白果中含量甚微，藥材中又存在大量復(fù)雜基質(zhì)，用傳統(tǒng)的提取分離方法較難有效地從白果中提取銀杏酸。筆者參考2010年版《中國藥典》（一部）銀杏葉提取物總銀杏酸檢查項下方法[1]及有關(guān)文獻(xiàn)[10]，采用C18固相萃取小柱對樣品進(jìn)行純化精制，擬定白果中總銀杏酸的含量測定方法，其準(zhǔn)確度與重復(fù)性考察均獲得了較滿意的結(jié)果，適用于白果中總銀杏酸的含量分析。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜（HPLC）儀、色譜工作站（美國Agilent公司）。

總銀杏酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號:110770-220510）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純；8批市售白果藥材分別來源于貴州貴陽、貴州羅甸、貴州水城、四川都江堰、四川汶川等地，經(jīng)本所熊慧林主任藥師鑒定為銀杏科植物銀杏G.biloba L.的干燥成熟種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相:甲醇-3%冰醋酸（91∶9）；檢測波長:310 nm；柱溫:30 ℃；流速:1.0mL·min-1。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取總銀杏酸對照品20.73mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品貯備液（0.2073mg·mL-1）。再精密量取5mL此貯備液，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得對照品溶液（0.10365mg·mL-1）。

2.3 供試品溶液的制備

取白果細(xì)粉（過三號篩）約2.5 g，置具塞錐形瓶中，精密稱定，精密加入無水甲醇25mL，稱定，80℃水浴中回流3 h，放冷，用無水甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液15mL，80℃水浴揮至近干，用75%甲醇2mL溶解轉(zhuǎn)移至已處理好的C18固相萃取小柱（先用無水甲醇10mL沖洗，再用75%的甲醇溶液10mL沖洗，小柱上加脫脂棉少許）上，繼續(xù)用75%甲醇5mL洗脫，洗脫液棄去。再用無水甲醇約4.5mL洗脫，洗脫液收集于5mL量瓶中，加無水甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

分別精密吸取對照品溶液10μL與供試品溶液10～20μL，注入液相色譜儀測定，按外標(biāo)法計算，即得。

2.4 專屬性考察

在“2.1”項下色譜條件下，總銀杏酸與其他組分可達(dá)到基線分離。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.總銀杏酸對照品；B.供試品Fig 1 HPLC chromatogramsA.ginkgolic acids control；B.test sample

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取總銀杏酸對照品溶液（0.10365mg·mL-1）6、10、14、20、24 μL（0.6219、1.0365、1.4511、2.0730、2.4876μg），注入液相色譜儀測定，按“2.1”項下色譜條件測定總峰面積。以總峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，總銀杏酸進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝413.2750X－4.2990（r＝0.9999，n＝5）。結(jié)果表明，總銀杏酸進(jìn)樣量在0.6219～2.4876μg范圍內(nèi)與總峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。擬合成過原點的直線方程為Y＝410.9284451X。將線性關(guān)系考察的最低進(jìn)樣量與最高進(jìn)樣量分別代入兩方程進(jìn)行計算，所得峰面積相對偏差為0.62%（低）～0.0031%（高），由此可作截距近似為0，故本文中采用外標(biāo)一點法計算總銀杏酸含量。

2.6 精密度試驗

精密吸取總銀杏酸對照品溶液（0.10365mg·mL-1）10 μL，注入液相色譜儀，重復(fù)測定5次，按“2.1”項下色譜條件測定總峰面積。結(jié)果，RSD＝1.08%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取白果細(xì)粉（過三號篩）約2.5 g，置具塞錐形瓶中，精密稱定，共6份，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取20μL，進(jìn)樣測定含量。結(jié)果，總銀杏酸的平均含量為0.2021mg·g-1，RSD＝1.58（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取白果細(xì)粉（過三號篩）約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于不同時間（0、2、4、6、8、10、12 h）精密吸取 20μL，進(jìn)樣測定。結(jié)果，RSD＝0.74%（n＝7），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已測知含量（0.2021mg·g-1）的樣品約1.3 g，精密稱定，共6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對照品溶液（0.2073mg·mL-1）1.3mL，置80 ℃水浴上揮盡溶劑，放冷，自“精密加入甲醇25mL，稱定……”起，按“2.3”項下方法操作，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.10 耐用性試驗

選擇3種不同品牌色譜柱[Aglient Ecilipse XDB-C18（150mm×4.6mm，5μm）、Waters Symmetry C18（150mm×4.6mm，5μm）、Ultimate XB-C18（250mm×4.6mm，5μm）]，檢測同一批次

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.11 樣品含量測定

取市售白果藥材8批，依法測定含量，結(jié)果見表2。樣品，每一批次平行測定2份。結(jié)果，RSD＝1.93%（n＝6），表明色譜柱的改變對測定結(jié)果無顯著影響。

表2 樣品含量測定結(jié)果Tab 2 Results of content determination of samples

3 討論

白果既含有大量水溶性雜質(zhì)，又含有較多的親脂性雜質(zhì)。由于總銀杏酸有一定的脂溶性，筆者曾采用正己烷、石油醚等極性較低的溶劑提取總銀杏酸，硅膠柱精制供試品，但僅有微量銀杏酸檢出，表明方法不適用于白果中銀杏酸的分析。又曾參考文獻(xiàn)以極性較低溶劑石油醚索氏提取樣品，以去除白果中大量極性較大的水溶性雜質(zhì)，但經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)石油醚的提取效率不高，平行樣品測定結(jié)果的偏差較大?？紤]到銀杏酸在甲醇中易溶解，本研究采用80℃甲醇回流提取樣品，同時考察了提取時間，以回流3 h的測定值最高，若增加提取時間，含量測定值不再增高，從而確定樣品提取方法為80℃甲醇回流提取3 h。但甲醇提取物含雜質(zhì)較多，會干擾測定，且損害色譜柱的使用壽命。故本研究采用與液相色譜柱填料相近的C18小柱進(jìn)行固相萃取，甲醇提取物以75%甲醇溶液洗脫，除去極性較大的雜質(zhì)，再收集一定體積的甲醇洗脫液，洗脫液中含總銀杏酸，剩余的大量脂性雜質(zhì)則保留在小柱上，從而有效地除去了雜質(zhì)的干擾，保證了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

筆者考察了不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇溶液作洗脫溶劑的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用75%甲醇溶液作洗脫劑，收集量為5mL，洗脫液中檢出大量雜質(zhì)但無總銀杏酸；再收集5mL洗脫液，洗脫液中僅有少量雜質(zhì)檢出。再以80%甲醇溶液5mL作洗脫劑，洗脫液中有少量總銀杏酸檢出。因此，確定采用75%甲醇溶液5mL作洗脫劑，可洗脫試樣中大量的極性較大雜質(zhì)，保留于小柱上的總銀杏酸再以約5mL無水甲醇洗脫，獲得了較滿意的結(jié)果。

試驗比較了3種不同品牌色譜柱（見“2.10”項），在上述色譜條件下，樣品色譜中總銀杏酸各峰與其他雜質(zhì)峰均能達(dá)到基線分離。3種色譜柱的柱效以總銀杏酸組峰中白果酸C15峰計算均不低于5000，考慮到色譜柱的差異及使用壽命等影響因素，暫定在分離度符合藥典要求的前提下，色譜柱的理論板數(shù)按白果酸C15峰計算應(yīng)不低于3000。

經(jīng)試驗，發(fā)現(xiàn)有部分批次市售白果的總銀杏酸含量超過國際限量標(biāo)準(zhǔn)（200mg·kg-1），且不同來源渠道白果中銀杏酸含量差異較大，這可能與銀杏產(chǎn)地、采收時間、銀杏樹齡及藥材采收后的處理條件等有關(guān)。試驗結(jié)果提示應(yīng)對白果的食用安全性引起重視，增加總銀杏酸的質(zhì)控指標(biāo)，并對藥材采集后的處理條件參數(shù)（如蒸、煮、烘干等環(huán)節(jié)中的具體溫度、時間、壓力等）作進(jìn)一步的明確。

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