退行性心臟瓣膜病患者血清中MHC、IRF-4、HSP70、HSP22 mRNA表達(dá)的變化及意義

于智勇 陳月云

老年退行性心臟瓣膜病(SDHVD)又稱老年鈣化性心臟瓣膜病，是隨年齡增長而表現(xiàn)的心臟瓣膜老化、退行性變和鈣鹽沉積所致的心臟瓣膜病。臨床表現(xiàn)為心律失常、心衰、暈厥以及猝死等，隨著我國老齡化社會(huì)的形成，老年心臟瓣膜病患者也逐漸增多，大多數(shù)患者需行心瓣膜置換術(shù)治療，給身心健康帶來了巨大的威脅。SDHVD的發(fā)病機(jī)制還不明確，本研究將通過觀察SDHVD患者血清肌球蛋白重鏈(MHC)、干擾素調(diào)節(jié)因子-4(IRF-4)、熱休克蛋白70(HSP70)、熱休克蛋白22(HSP22)mRNA表達(dá)水平探討SDHVD的可能發(fā)病機(jī)制，并對(duì)與心功能的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 根據(jù)SDHVD診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］，經(jīng)彩色多普勒超聲心動(dòng)圖檢查，選擇本科室2009年10月至2010年11月SDHVD住院患者65例，其中單純老年主動(dòng)脈瓣鈣化(AVC組)25例，男18例，女7例，年齡62～87歲，平均(78.36±6.5)歲;單純老年性二尖瓣鈣化(MVC組)19例，男14例，女5例，年齡61～82歲，平均(76.3±5.53)歲;主動(dòng)脈瓣鈣化合并二尖瓣鈣化(AVC+MVC組)21例，男15例，女6例，年齡60～91歲，平均(79.28±6.15)歲;另選同期住院非SDHVD患者(對(duì)照組)24例，男16例，女8例，年齡63～86歲，平均(77.14±6.2)歲。并排除風(fēng)濕性、梅毒性、乳頭肌功能不全、腱索斷裂以及感染性心內(nèi)膜炎等原因所致的瓣膜病變，并且無先天性結(jié)締組織異常和鈣磷代謝異常的疾病或病史。同時(shí)利用彩色超聲心動(dòng)圖測定左房、左室大小及左室收縮與舒張功能參數(shù)。并按NYHA分級(jí)評(píng)定心功能。

1.2 RT-PCR 取由臨床采集患者肝素抗凝血樣2 ml，采用Trizol一步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取2 μg總RNA作為模板，oligo-dT作引物，逆轉(zhuǎn)錄酶為AMV，反應(yīng)體系為10 μl。MHC引物序列為:上游:5'-GTGCGACAACACTTATGAAA-3'，下 游:5'-AAACAGCCGTCCTGAGAT-3'，退火溫度53.7℃，擴(kuò)增產(chǎn)物長度 317bp;IRF-4引物序列為:上游:5'-TGAGCGAGGGCATAAATACAG-3'， 下 游:5'-CTTCACGCACCATTCAGACAG-3'，退火溫度50℃，擴(kuò)增產(chǎn)物長度307 bp;HSP70上游:5'-CACCACCTACTCCGACAACCA-3'，下 游:5'-GCCCCTAATCTACCTCCTCAATG-3'，退火溫度50℃，擴(kuò)增產(chǎn)物長度647 bp;HSP22上游:5'-CCTTCTCCTGCCACTACCC-3'，下游:5'-TGCCAGACACCTCCACGT-3'，退火溫度50℃，擴(kuò)增產(chǎn)物長度351 bp;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上游:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'產(chǎn)物長度452 bp。PCR反應(yīng)條件:94℃(預(yù)變性)1 min 1次;94℃(變性)1 min，55℃(退火)30 s，72℃(延伸)30 s共30個(gè)循環(huán);72℃(延伸)5 min 1次;即上PCR儀，PCR產(chǎn)物即進(jìn)行電泳或凍存，MHC循環(huán)數(shù)30;IRF-4循環(huán)數(shù)30;HSP70循環(huán)數(shù)26;HSP22循環(huán)數(shù)30。

1.3 PCR產(chǎn)物電泳分析 配制1%瓊脂糖凝膠，加入終濃度為0.5 μg/ml的溴化乙錠(EB);取5 μl PCR 終產(chǎn)物及DNA marker，以1×TAE為緩沖液，電壓80 V，電泳20 min，采用Tanon凝膠成像與分析系統(tǒng)Image System Ver 4.0測定擴(kuò)增產(chǎn)物條帶平均光密度值(圖1)。結(jié)果以目的基因mRNA與GAPDH mRNA的比值表示，進(jìn)行半定量比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 12.0專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，記量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料以百分比表示;多組間比較用方差分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn);相關(guān)性研究采用直線相關(guān)分析。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者基礎(chǔ)資料比較 SDHVD瓣膜鈣化各組與對(duì)照組以及各瓣膜鈣化組之間年齡、性別及合并高血壓、冠心病、糖尿病均無明顯差異(P＞0.05)。瓣膜鈣化各組Ⅲ級(jí)以上心功能例數(shù)與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01)，而瓣膜鈣化各組之間Ⅲ級(jí)以上心功能例數(shù)相比無顯著差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組患者基礎(chǔ)資料比較

2.2 各組患者血清檢測指標(biāo)及心臟結(jié)構(gòu)與功能比較

MVC、AVC、AVC+MVC各組與對(duì)照組相比 MHC、IRF-4、HSP70、HSP22、左房內(nèi)徑、左室內(nèi)徑、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05);而不同瓣膜鈣化各組之間 MHC、IRF-4、HSP70、HSP22、左室內(nèi)徑、LVEF均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其中MVC組與AVC組、AVC+MVC組左房內(nèi)徑相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);MVC、AVC、AVC+MVC和對(duì)照組各組之間左室舒張功能參數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，SDHVD患者血清 MHC和IRF-4 mRNA表達(dá)量明顯降低，HSP70和HSP22 mRNA表達(dá)量明顯增高，而不同瓣膜鈣化損傷間無明顯差異。見表2。

表2 各組患者血清檢測指標(biāo)及心臟結(jié)構(gòu)與功能比較(±s)

表2 各組患者血清檢測指標(biāo)及心臟結(jié)構(gòu)與功能比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05＊＊P＜0.01;與MVC組比較，△△P＜0.01

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2.3 血清MHC、IRF-4、HSP70、HSP22與心功能相關(guān)性分析 SDHVD患者血清MHC、IRF-4與LVEF呈正相關(guān)(r分別為0.394、0.427，P ＜0.05)，HSP70、HSP22與LVEF呈負(fù)相關(guān)(r分別為 －0.409、－0.422，P＜0.05)。

3 討論

目前國內(nèi)外研究均認(rèn)為SDHVD很可能是一種多因素參與、被動(dòng)和主動(dòng)交替出現(xiàn)的過程，其病理生理基礎(chǔ)包含了基膜破裂、細(xì)胞凋亡、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞遷移、脂質(zhì)滲透及鈣鹽沉積等過程［2］。與高血壓、主動(dòng)脈硬化、冠心病、高膽固醇血癥、腦卒中等疾病高度相關(guān)，其中以單純主動(dòng)脈瓣病變最多見，其次為主動(dòng)脈瓣合并二尖瓣病變及單純二尖瓣病變，這可能是隨著年齡增長，主動(dòng)脈瓣和二尖瓣長期承受大的血流沖擊，瓣膜機(jī)器支架易受破壞，引起瓣膜的纖維化和主動(dòng)的異位鈣化有關(guān)［3］。已證實(shí)多種介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子 1(TGF-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白介素-1β及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)參與瓣膜鈣化與狹窄的發(fā)生發(fā)展過程［4］。

肌球蛋白是將儲(chǔ)存在ATP中的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能的分子馬達(dá)，與信號(hào)傳導(dǎo)、肌肉收縮、趨化性遷移和細(xì)胞形狀的改變等有關(guān)［5］。老年人單核細(xì)胞肌球蛋白減少，可能影響到免疫細(xì)胞的許多功能［6］，例如B細(xì)胞分泌抗體的速度，巨噬細(xì)胞向炎癥部位的移動(dòng)效率，影響抗原提呈細(xì)胞表達(dá)MHC分子的效率等等，最終導(dǎo)致衰老免疫功能的低下。

干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)家族是能對(duì)干擾素的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的一類轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程，維持著CD4+T細(xì)胞的功能、分化及自穩(wěn)平衡，對(duì)人體免疫功能有著重要的調(diào)節(jié)作用。隨著年齡增長，淋巴細(xì)胞中IRF-4減少時(shí)，巨噬細(xì)胞就會(huì)過多地釋放前炎癥因子［7］，進(jìn)一步造成細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致心肌組織自身免疫反應(yīng)。

HSP70可提高細(xì)胞對(duì)各種損傷因子的耐受能力，起保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的作用。Pantos等［8］通過結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈建立心肌梗死模型，發(fā)現(xiàn)心肌HSP70的表達(dá)能明顯提高，并能同時(shí)增加心肌對(duì)隨后的缺血/再灌注的抗性。同時(shí)指出，HSP70內(nèi)源性保護(hù)途徑可能是通過抗氧化和抗凋亡機(jī)制來達(dá)到這一目的。

HSP22具有絲/蘇氨酸激酶活性，是一種磷蛋白。HSP22不僅有分子伴侶的作用還有抗凋亡的作用［9］，HSP22可激活心肌腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、PI3K/Akt通路、PKCE等抗凋亡、細(xì)胞保護(hù)、預(yù)適應(yīng)和代謝刺激等存活通路，保護(hù)缺血損傷心肌［10］。

本研究發(fā)現(xiàn)，SDHVD各組與對(duì)照組的MHC、IRF-4、HSP70、HSP22 mRNA表達(dá)量相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)SDHVD各組與對(duì)照組相比LVEF下降明顯，舒張功能參數(shù)則無明顯差異，SDHVD患者血清MHC、IRF-4的含量與 LVEF呈正相關(guān)，HSP70和HSP22 mRNA表達(dá)量與LVEF呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果提示，血清 MHC、IRF-4、HSP70、HSP22 mRNA 表達(dá)量和瓣膜鈣化關(guān)系明顯，但和瓣膜鈣化發(fā)生的部位關(guān)系不大，且SDHVD患者心功能失調(diào)以收縮功能衰竭為主。

隨著人類預(yù)期壽命的增長，SDHVD發(fā)病率逐漸增高，將成為老年臨床心臟病學(xué)的一個(gè)重要問題，SDHVD應(yīng)引起臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究者的高度重視，而監(jiān)測血清 MHC、IRF-4、HSP70、HSP22 mRNA 表達(dá)量有助于SDHVD的早期診斷和探討新的干預(yù)措施。

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