犬瘟熱病毒重組囊膜糖蛋白（H/F）全長質粒的構建

王 磊 ，馮 娜 ，李天松 ，劉玉秀 ，高玉偉 ，王鐵成 ，楊松濤 ，夏咸柱

（1.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130062；2.吉林農(nóng)業(yè)大學，吉林 長春 130062；3.吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，吉林 長春 130062）

犬瘟熱是由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒（CDV）引起多種動物的一種急性、熱性、高度接觸性病毒性傳染病[1]。CDV自然感染宿主在不斷擴大，除犬科動物外，還可感染大熊貓、小熊貓、獅、虎和豹等食肉目所有8個科，偶蹄目豬科、靈長目的獼猴屬和鰭足目海豹科等多種動物。國內(nèi)外對犬瘟熱的預防仍然主要依賴于弱毒疫苗，而弱毒疫苗在使用過程中存在返祖、首免時受到母源抗體的干擾、引起一過性的免疫抑制和血小板減少、導致免疫動物發(fā)生腦炎等現(xiàn)象[2]，因此，犬瘟熱病毒新型疫苗的研究迫在眉睫。

反向遺傳學技術（reverse genetic technique）是上世紀90年代在分子病毒學研究領域興起的新技術，也被稱為“病毒拯救（ the rescue of virus）”。1994年Schnell利用反向遺傳學技術首次成功拯救出狂犬病毒（RV），為負鏈RNA病毒的研究提供新的思路[3]。運用反向遺傳技術可從cDNA水平進行RNA病毒改造，可以有目的地改變病毒基因組結構，獲得有感染性的重組病毒，從而研發(fā)出新型減毒活疫苗和新型病毒表達載體[4]。本實驗室已經(jīng)成功構建了CDV/R-20/8弱毒株全長cDNA質粒和病毒蛋白N、P、L基因的輔助表達質粒，利用T7啟動子和表達T7 RNA聚合酶的BSR細胞構成的表達系統(tǒng)進行病毒拯救，獲得成功。在此基礎上我們對全長cDNA質粒進行定向改造，將本病毒本身的F和H基因序列插入到M基因前非編碼區(qū)，構建帶有雙囊膜糖蛋白的全長cDNA質粒，為下一步拯救具有雙囊膜糖蛋白基因的CDV和開展更為安全高效的重組CDV活載體疫苗及CDV病毒相關機制的研究奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

犬瘟熱病毒CDV/R-20/8疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)及表達綠色熒光蛋白的重組犬瘟熱病毒全長質粒（pCI-CDV-EGFP）、含犬瘟熱病毒H和F基因的重組質粒pBluescript-F和pBluescript-H由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所人畜共患病研究室提供；T4 DNA連接酶、Pme I限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；其它限制性內(nèi)切酶均購自 TaKaRa 公司；Dephospharylation（BAP）Kit、2×PCR Solution Premix PrimeSTARRHS 購自TaKaRa公司；DH5α、TOP10感受態(tài)細胞購自北京全式金公司；質粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒pBluescript-F和pBluescript-H的轉化及回收

重組質粒pBluescript-F和pBluescript-H轉化DH5α感受態(tài)細胞，采用熱激法轉化，氨芐抗性平板篩選陽性菌落后挑取單菌落，用LB培養(yǎng)基進行搖菌，菌液OD值達0.5時按AXYGEN小提試劑盒進行質粒小量提取，1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計對質粒大小和濃度進行鑒定。

1.2.2 重組質粒 pBluescript-F、pBluescript-H、pCI-c1-EGFP酶切及載體去磷酸化

用PmeI限制性內(nèi)切酶對重組質粒pBluescript-F、pBluescript-H、pCI-c1-EGFP（c1 為 CDV基因組中的一段450 bp序列，在犬瘟熱病毒全基因中的位置為2962～3371）分別進行單酶切，按AXY GEN凝膠回收試劑盒說明書回收酶切產(chǎn)物CDV-F、CDV-H基因片段及pCI-c1載體。pCI-c1載體回收后兩端為平末端，防止載體出現(xiàn)自連需去除5’端磷酸基團，按 Dephospharylation（BAP）Kit說明書操作，反應體系 50μL :10 ×BAP Buffer 5μL 、Bacterial Alkaline Phosphatase（BAP）2.5μL、載體片段 30μL、雙蒸餾水補至50μL。65℃水浴30min，去磷結束后回收載體，加入50μL的滅菌蒸餾水，即終體積為100μL，加入 300μL的 Buffer DE-A 及 150μL Buffer DE-B，混合均勻后置于制備管中，后續(xù)操作與凝膠回收一致。純化后的載體及CDV-F和CDV-H基因片段分別取出1μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小及濃度。

1.2.3 pCI-c1-F和pCI-c1-H質粒的構建

根據(jù)純化后載體與F、H目的片段按載體:片段摩爾比1:3進行連接，連接用10μL反應體系:10×T4 DNA 連接酶 Buffer 1μL、T4 DNA 連接酶 0.5μL、載體 2.5μL、目的基因片段（CDV-H、CDV-F）6μL。16℃連接過夜。熱激法轉化DH5α感受態(tài)細胞。分別用EcoR I和BglII內(nèi)切酶鑒定pCI-C1-F和pCI-C1-H質粒，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 全長質粒pCI-CDV-F和pCI-CDV-H的構建

對全長質粒pCI-CDV-EGFP和正向連接的重組pCI-c1-F和pCI-c1-H質粒用Sal I和Mlu I同時進行雙酶切，全長質?；厥沾筝d體（pCI-CDV-），重組pCI-c1-F和pCI-c1-H質粒回收c1-F和c1-H目的基因片段。根據(jù)載體與目的片段大小和濃度，將載體與目的基因片段摩爾比為1:10進行16℃連接過夜，轉化TOP 10感受態(tài)細胞，平板30℃倒置培養(yǎng)，大量篩選陽性克隆并分別命名為pCI-CDV-F、pCI-CDV-H。

1.2.5 重組全長質粒鑒定

1.2.5.1 PCR鑒定

根據(jù)犬瘟熱病毒CDV/R-20/8疫苗株全基因序列，用Primer 5.0軟件設計3對引物，由北京華大基因公司合成，引物序列如下:

PCR 反應總體系 25μL:滅菌純水 18.25μL、10×ExBuffer 2.5μL、2.5mmol/L dN TP 2μL、ExTaq 0.25μL、上游引物（20 pmol/μL）0.5μL、下游引物（20 pmol/μL）0.5μL、重組質粒 1μL。PCR 反應條件為:95℃預變性 5min；95 ℃變性 30 s，50 ℃退火 40 s，72 ℃延伸1.5min，35個循環(huán):72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果。

在后備牛不同年齡階段，生長速度可能會影響乳房發(fā)育，但是在斷奶之后有影響，并不是斷奶前。圖1可以看出，3月齡前，體重生長曲線和乳腺增長曲線完全一致，這意味著，在3月齡前，不管怎么飼養(yǎng)，提供的營養(yǎng)物質是高或是低，牛長得快或慢，都不會對乳腺組織發(fā)育產(chǎn)生影響，即不會對后期產(chǎn)奶產(chǎn)生影響。

c引物擴增完整外源基因:

PCR反應總體系為 50μL，用 Premix Prime STAR HS預混液進行擴增，擴增條件:95℃預變性5min；98 ℃ 變性 10 s，55 ℃退火 15 s，72 ℃ 延伸 3min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增結果，初步鑒定正確后將PCR產(chǎn)物進行精測序。

1.2.5.2 酶切鑒定

初步使用Pme I單酶切和Sal I+Mlu I雙酶切進行鑒定，鑒定正確后用Sal I+Not I進行雙酶切及用 Pst I、Cpo I、Xho I、Nhe I、Sma I進行單酶切鑒定，酶切鑒定體系都為20μL，酶切體系和條件按TaKaRa內(nèi)切酶說明書操作過程見圖1和2示意圖。

2 結果

2.1 重組質粒 pBluescript-F、pBluescript-H和pCI-c1-EGFP的Pme I酶切結果

質粒pBluescript-H和pBluescript-F中，H和F基因兩端分別設計成相同的PmeI位點，單酶切時分別可以切下大小為 2036 bp（CDV-F）和 1886 bp（CDV-H）的目的片段，質粒pCI-c1-EGFP中，EGFP基因兩端為PmeI酶切位點，可切下726bp的片段（圖3）。

2.2 重組質粒pCI-c1-F和pCI-c1-H酶切及正反向鑒定

Pme I酶切后為平末端，CDV-F和CDV-H基因連接到pCI載體上后需進行正反向鑒定，用EcoR I酶切pCI-c1-F質粒后若是正連，酶切結果為:1413 bp和4987 bp；若反連，酶切結果為575 bp和5825 bp。對pCI-c1-H質粒，若正連，Bgl II內(nèi)切酶進行酶切后可切出3724 bp和2468 bp；若是反連，酶切后可以切出4745 bp和1078 bp。圖4結果顯示篩選出連接正確的陽性重組質粒pCI-c1-F和pCI-c1-H。

2.3 重組全長質粒pCI-CDV-F、pCI-CDV-H PCR及酶切鑒定

PCR鑒定過程中，上游引物在插入的CDV-F和CDV-H基因中，下游引物在插入基因的外面，對CDV-F基因，上游引物在6352 bp位置（F基因在全基因組中的位置為:4935～6923 bp），對CDV-H基因，上游引物在7954 bp位置（H基因在全基因組中的位置為:7079～8902 bp）；下游引物在全基因組中的位置為4043 bp，以上兩種基因插入的位置為全基因組中3371 bp，因此若無目的片段插入，兩對引物均不能擴增出條帶；對pCI-CDV-F質粒，若正確插入目的片段，可擴增出1243 bp片段；對pCI-CDV-H質粒，可擴增出1611 bp片段。而第三對引物擴增出的片段大小 pCI-CDV-F為2686 bp、pCI-CDV-H為 2536 bp。如圖5所示PCR擴增結果均正確。

2.3.2 酶切鑒定結果

CDV-H和F基因兩端均為Pme I酶切位點，用此酶進行單酶切時可以從全基因質粒中切出CDV-F為2036 bp和CDV-H為1886 bp的片段。Pme I酶切位點上游410 bp左右的位置含Sal I酶切位點，下游2 bp位置含Mlu I酶切位點，用以上兩種酶同時進行雙酶切，可以從全基因質粒中酶切出目的片段為:CDV-F（2486 bp）、CDV-H（2336 bp）。酶鑒定正確后，用 Noc I、Xho I、Sma I、Nhe I、Pst I進行單酶切鑒定，Sal I+Not I進行雙酶切鑒定全長質粒丟失情況，鑒定結果如圖6所示，沒有發(fā)現(xiàn)質粒丟失，與計算結果一致。

3 討論

犬瘟熱病毒基因組為非分節(jié)段的單股負鏈RNA。負鏈RNA病毒的主要特點是基因組RNA不具有感染性，而且裸露的基因組RNA本身也不能作為模板，只有在與核蛋白N/NP結合成核糖核蛋白（RNP）復合體后，才能作為模板起始復制和轉錄，并表達和包裝出活病毒，關鍵是獲得有功能的RNP[5]。RNA病毒感染性克隆的構建，實現(xiàn)了從病毒整體與分子之間、病毒與宿主關系方面研究病毒的毒力和致病性。采取基因敲除、插入、置換、或構建嵌和病毒等方法對病毒基因功能進行研究，本研究旨在將犬瘟熱病毒的囊膜糖蛋白插入到M基因前面的非編碼區(qū)，構建重組CDV cDNA全長質粒。使用了pCI真核表達載體，CMV/T7啟動子的反向遺傳操作系統(tǒng)。T7啟動子是一種具有高特異性和功能強大的原核啟動子，但在真核細胞感染表達T7 RNA聚合酶的BSR細胞（本實驗室已經(jīng)成功在BSR細胞中拯救出犬瘟熱病毒），同樣可以使真核細胞中的T7啟動子序列發(fā)揮轉錄作用[6]。

CDV囊膜表面的纖突是由H和F兩種糖蛋白組成的[7]。研究表明H、F蛋白是宿主免疫系統(tǒng)的主要目的抗原，是產(chǎn)生中和抗體的重要抗原。二者在病毒的吸附和侵入宿主細胞過程中起作用，病毒通過H蛋白吸附到細胞表面的受體上，并協(xié)助F蛋白介導病毒囊膜與宿主細胞膜、感染細胞與非感染細胞的融合，使病毒在宿主體內(nèi)擴散。H蛋白主要誘導了體液免疫，并且抗CDV H蛋白單克隆抗體（MoAb）具有中和病毒活性；F蛋白誘導的免疫反應能阻止病毒感染，并且在有病毒增殖的情況下抑制癥狀的發(fā)生。用相關或非相關病毒的糖蛋白基因取代自身糖蛋白基因后的重組病毒也已成功用于疫苗研制[8]。在狂犬病毒（RV）研究中，RABV G 蛋白是唯一的膜蛋白并誘導VNA（中和抗體）的產(chǎn)生，額外的RABV G 蛋白（2個或3個）被克隆至RABV 基因組，并成功拯救出攜帶2～3個G蛋白基因的衰減病毒，使得G蛋白表達量增加，其致病性進一步下降，免疫原性提高，由此可見，過度表達G蛋白可潛在的增強適應性免疫應答及提高保護率[9-10]。本研究選擇囊膜糖蛋白并分別構建了雙囊膜糖蛋白基因的全長質粒，其目的就是想借助反向遺傳操作平臺進行免疫原性比較，篩選出致病性低、免疫原性好的致弱犬瘟熱病毒疫苗株，并對其致病機理進行進一步探討。

病毒基因組全長片段的克隆是反向遺傳操作技術的關鍵環(huán)節(jié)，全長cDNA克隆的穩(wěn)定性嚴重制約病毒拯救的效率。本試驗在篩選全長質粒中存在著大量質粒片段丟失情況，用DH5a感受態(tài)細胞先后轉化篩選數(shù)百次都未獲得成功，改用TOP10感受態(tài)細胞時，將轉化后氨芐篩選平板溫度降低到30℃進行培養(yǎng)，挑取陽性菌落后在30℃環(huán)境中液體搖菌培養(yǎng)，最終篩選出完整的全長質粒。這種病毒基因組插入載體轉化大腸桿菌后易出現(xiàn)突變、重排、缺失、插入和替換現(xiàn)象，原因之一可能是重組質粒中的某些基因對宿主菌有毒性，使有重組載體的菌死亡或者宿主菌為存活需要對重組載體進行“改造”，從而導致了全長基因克隆的不穩(wěn)定[11]。

表達細胞色素C的重組狂犬病毒可以加速細胞凋亡，進而增強免疫應答并降低致病性。在病毒基因組表達細胞因子可以潛在增強病毒的免疫應答，進而起保護作用[12]，為下一步定向改造犬瘟熱病毒提出另一路線。以構建CDV全長cDNA質粒為基礎，進行基因突變或與其它疫苗株及野生毒株基因置換，以及天然免疫相關細胞因子的插入研究等，可以建立CDV免疫原性和致病性的研究平臺，同時引入外源基因進行表達，提高疫苗的保護率等方面的研究正在進行。

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