MRPL48基因在代謝綜合征診斷中的意義探討

孫魯寧，張 寧，宋曉宇，鄭寧寧，張海鵬

代謝綜合征 (metabolic syndrome，MS)是各種代謝危險(xiǎn)因素在同一個(gè)體中簇集的狀態(tài)，以中心性肥胖、高血糖、血脂異常、高血壓等聚集發(fā)病為特征。近年來，MS發(fā)病率在全球呈迅速上升趨勢(shì)，歐美等國家MS已累及成年人口的1/4［1］;中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病分會(huì)的一項(xiàng)最新調(diào)查結(jié)果顯示，我國MS的總體患病率為13.7%［2］。目前診斷MS的標(biāo)準(zhǔn)主要是依據(jù)患者的血生化檢測(cè)結(jié)果制定的，因患者的個(gè)體差異很大，僅憑血生化檢測(cè)結(jié)果往往不足以反映機(jī)體的整體代謝狀況。若能從MS的發(fā)病機(jī)制入手，在基因或蛋白質(zhì)水平上找到更加理想的特異性診斷標(biāo)準(zhǔn)，無疑會(huì)對(duì)MS的臨床診治產(chǎn)生重要的意義。

線粒體是細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的中心樞紐，它在細(xì)胞代謝過程中起著重要作用。近十多年來，線粒體功能與MS的關(guān)系正逐漸受到關(guān)注。線粒體核糖體負(fù)責(zé)線粒體基因 (mtDNA)編碼蛋白的翻譯，其異常會(huì)引起線粒體膜電位下降和能量產(chǎn)生不足，從而引起體內(nèi)的各種代謝障礙，進(jìn)而導(dǎo)致MS的發(fā)生?；诖?，本研究采用RNA干擾的方法抑制Hela細(xì)胞線粒體核糖體大亞基蛋白48(mitochondrial ribosomal proteins，MRPL48)基因的表達(dá)，觀察線粒體膜電位的改變，從而明確MRPL48在維持機(jī)體能量代謝中的作用，并進(jìn)一步探討MRPL48在MS臨床診治中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 GIBCO?DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清 (Invitrogen公司);MRPL48 shRNA質(zhì)粒 (Open Biosystems公司);LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑 (Invitrogen公司);WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒 (博士德公司);MRPL48抗體(Abcam公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗人二抗 (Sant Cruz公司);硝酸纖維素膜 (Bio-Rad公司);線粒體熒光染料JC-1(Molecular Probes公司)。

1.2 方法

1.2.1 Hela細(xì)胞培養(yǎng) 向含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中加入100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，在7.5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng) (37°C)。

1.2.2 病毒包裝和轉(zhuǎn)染 將PA317細(xì)胞接種于6孔板，待其長(zhǎng)滿約80%時(shí)，使用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000將pLNCX逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體和shMRPL48轉(zhuǎn)入PA317細(xì)胞，6 h后換液，24 h后收集病毒并轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。

1.2.3 Western blotting方法檢測(cè)MRPL48的表達(dá) 取40μg蛋白10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉該膜37℃ 1 h，再加入MRPL48抗體(1∶500)4℃孵育過夜。經(jīng)ECL顯影后，用電泳凝膠成像分析系統(tǒng) (Chemiimager 5500 ALPHA INNOTECH U.S.A)分析光密度值。

1.2.4 JC-1染色法觀察線粒體膜電位的變化 線粒體將產(chǎn)生的能量以電化學(xué)位能儲(chǔ)存于線粒體內(nèi)膜，稱為線粒體膜電位，其變化可作為反映線粒體能量代謝改變的敏感指標(biāo)。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以檢測(cè)到線粒體膜電位的下降。分別收集3×105RNA干擾組和對(duì)照組Hela細(xì)胞，加入0.5 mg/ml JC-1溶液，37°C避光靜置20 min后，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞2次，用熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位變化。

2 結(jié)果

2.1 RNA干擾組和對(duì)照組Hela細(xì)胞MRPL48蛋白表達(dá) 電泳凝膠成像分析系統(tǒng)分析光密度值顯示:RNA干擾組Hela細(xì)胞MRPL48蛋白表達(dá)較對(duì)照組減少58%(見圖1)，說明shRNA能有效抑制Hela細(xì)胞MRPL48蛋白的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)基因沉默效應(yīng)。

圖1 Western blotting檢測(cè)RNA干擾組和對(duì)照組Hela細(xì)胞MRPL48的表達(dá)Figure 1 Expression of MRPL48 in RNA interference Hela cells and the control by Western blotting

2.2 線粒體膜電位的變化 JC-1染色顯示，對(duì)照組Hela細(xì)胞線粒體染色后呈現(xiàn)紅色熒光顆粒，RNA干擾組Hela細(xì)胞線粒體綠色熒光顆粒明顯增加 (見圖2)，提示線粒體膜電位下降。

圖2 RNA干擾組和對(duì)照組Hela細(xì)胞線粒體膜電位改變 (JC-1染色，×40)Figure 2 Mitochondrial membrane potential changes of RNA interference Hela cells and the control(JC-1 staining， ×40)

3 討論

MS是由于先天的遺傳因素與后天的環(huán)境因素共同作用引發(fā)的一系列臨床、生化和體液代謝失常，從而引起糖類、脂類和蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)代謝異常的綜合征［3］。因其發(fā)病率正逐年增高，且嚴(yán)重威脅人類健康，已在世界范圍內(nèi)受到廣泛的關(guān)注。目前臨床上比較常用的MS診斷標(biāo)準(zhǔn)主要有3種，分別為2001年美國國家膽固醇教育計(jì)劃成人治療組第三次指南(NCEP-ATPⅢ)標(biāo)準(zhǔn)［4］，2005年國際糖尿病聯(lián)盟 (IDF)標(biāo)準(zhǔn)［5］，以及中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)根據(jù)中國人MS的研究，在2004年提出的診斷標(biāo)準(zhǔn) (CDS標(biāo)準(zhǔn))［6］。上述3種診斷標(biāo)準(zhǔn)盡管存在一定的差異，但均是主要依據(jù)患者的臨床生化檢測(cè)結(jié)果制定的。不同的診斷標(biāo)準(zhǔn)檢出的MS臨床患病率差異較大，并且受到年齡、民族、種族、性別等多因素的影響，這就給MS的臨床診治帶來了一定的困擾［7］。故本研究試圖從MS的發(fā)病機(jī)制入手，在基因或蛋白質(zhì)水平上找到更加理想的特異性診斷標(biāo)準(zhǔn)。

線粒體是細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的中心樞紐，涵蓋和控制著約189條生化代謝系列反應(yīng)，包括呼吸氧化、糖酵解、脂肪酸氧化、三羧酸循環(huán)、磷脂合成、蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)路徑等。所有糖類、脂類及蛋白質(zhì)代謝的最后階段都在線粒體內(nèi)經(jīng)三羧酸循環(huán)完成氧化。因而，Saris等［8］提出:所有代謝障礙最終均可歸因?yàn)榫€粒體的功能異常。線粒體也是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)惟一含有核外遺傳物質(zhì)的細(xì)胞器，線粒體基因 (mtDNA)全長(zhǎng)僅為16.6 kb(核基因組全長(zhǎng)為30億kb)。mtDNA的表達(dá)異?？稍斐删€粒體電子傳遞障礙，引起線粒體的能量代謝障礙，進(jìn)而參與神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、腫瘤等的發(fā)生［9-10］。線粒體核糖體負(fù)責(zé)翻譯13種mtDNA編碼蛋白。作為線粒體核糖體活性中心的線粒體核糖體蛋白 (mitochondrial ribosomal proteins，MRPs)是mtDNA正常表達(dá)的基礎(chǔ)。它由核基因編碼，在細(xì)胞質(zhì)中的核糖體上合成，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中，參與線粒體基因的表達(dá)［11］，其結(jié)構(gòu)和功能異?？赡軙?huì)影響mtDNA編碼蛋白的合成，使參與代謝的輔酶數(shù)量減少或活性降低，并使線粒體氧化磷酸化效率降低，導(dǎo)致糖類、脂類等物質(zhì)代謝紊亂，同時(shí)使ATP產(chǎn)生減少，后者可進(jìn)一步促進(jìn)代謝紊亂的發(fā)生發(fā)展。近年來，人類線粒體核糖體全部78個(gè)組成蛋白編碼基因的序列及染色體定位均已明確，使我們對(duì)MRP的進(jìn)一步研究有了可能。我們的前期研究結(jié)果已證明，并非所有的MRPs異常都會(huì)引起嚴(yán)重的代謝障礙［12］。因而，從78種MRPs中鑒定出影響線粒體代謝功能的關(guān)鍵蛋白，對(duì)于從分子水平上明確MS的診斷具有尤為重要的意義。

基于上述設(shè)想，本研究采用RNA干擾的方法抑制Hela細(xì)胞MRPL48的表達(dá)，觀察到細(xì)胞線粒體膜電位下降等損傷性改變，提示此時(shí)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了代謝障礙。也就證實(shí)了MRPL48是影響線粒體功能的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，該蛋白在細(xì)胞代謝過程中起到了非常重要的作用。MRPL48基因表達(dá)減少可能正是在MS患者在分子水平上的特異性變化。若上述設(shè)想得到證實(shí)，MRPL48將有望作為MS臨床診治的新靶點(diǎn)。今后，我們將繼續(xù)開展MS動(dòng)物模型的研究，以便進(jìn)一步提供相關(guān)的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 Guarente L.Sirtuins as potential targets for metabolic syndrome ［J］.Nature，2006，444(7121):868-874.

2 張鈺聰，關(guān)紹晨，吳曉光，等.北京市老年人代謝綜合征患病率及其與心腦血管病的關(guān)系 ［J］.疑難病雜志，2009，8(4):195.

3 趙崢.代謝綜合征的研究進(jìn)展 ［J］.實(shí)用心腦肺血管病雜志，2011，19(1):143.

4 Expert Panel on Detection，Evaluation，and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults.Executive summary of the third report of the national cholesterol education program(NCEP)expert panel on detection，evaluation，and treatment of high blood cholesterol in adults(Adult Treatment PanelⅢ)［J］.JAMA，2001，285:2486-2497.

5 Grundy SM，Cleeman JI，Daniels SR，et al.Diagnosis and management of the metabolic syndrome:an American Heart Association/National Heart，Lung，and Blood Institute Scientific Statement［J］.Circulation，2005，112(17):2735-2752.

6 中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)代謝綜合征研究協(xié)作組.中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)關(guān)于代謝綜合征的建議［J］.中華糖尿病雜志，2004，12(3):156-161.

7 任路平，宋光耀.高果糖飲食與代謝綜合征研究新進(jìn)展 ［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2011，14(4):1278.

8 Saris WH，Heymsfield SB.All metabolic roads lead to mitochondrial(dys)-function ［J］.Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2007，10(6):661-663.

9 Hsieh CJ，Weng SW，Liou CW，et al.Tissue-specific differences in mitochondrial DNA content in type 2 diabetes［J］.Diabetes Res Clin Pract，2011，92(1):106-110.

10 Kloss-Brandst?tter A，Sch?fer G，Erhart G，et al.Somatic mutations throughout the entire mitochondrial genome are associated with elevated PSA levels in prostate cancer patients ［J］.Am J Hum Genet，2010，87(6):802-812.

11 O'Brien TW，O'Brien BJ，Norman RA.Nuclear MRP genes and mitochondrial disease［J］.Gene，2005，354:147-151.

12 O'Brien TW，Wang RL，Sun LN.Specialized ribosomes in mammalian mitochondria.Mitochondrial Medicine.2010.Scottsdale， Arizona， U-nited States.