Toll樣受體引發(fā)宿主抵抗弓形蟲

潘磊，陳會(huì)，周玉剛，遲海

（1.安徽省蚌埠市畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣站，安徽蚌埠 233000；2.安徽科技學(xué)院，安徽鳳陽(yáng)233100；3.安徽省蚌埠市淮上區(qū)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)站，安徽蚌埠233000）

弓形蟲是一種重要的胞內(nèi)寄生原蟲，它可以在廣泛的動(dòng)物宿主和大部人群中建立廣泛穩(wěn)定的宿主-寄生關(guān)系。依賴MyD88的Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)是激發(fā)宿主對(duì)弓形蟲這種機(jī)會(huì)性致病寄生蟲防御能力的一種重要途徑，其也可能介導(dǎo)免疫功能障礙過程中的致病作用。其他MyD88的獨(dú)立的信號(hào)途徑也參與了宿主-寄生蟲的相互作用。這些反應(yīng)可由寄生蟲自身引發(fā)，但與腸道菌群的相互作用增加了額外的腸道感染復(fù)雜性。

一、前言

宿主對(duì)感染的防御依賴于有效的病原檢測(cè)機(jī)制和區(qū)分感染和非感染性物質(zhì)的能力。對(duì)于全球分布的原蟲——弓形蟲來說，感染的識(shí)別誘發(fā)一個(gè)快速和強(qiáng)大的、對(duì)弓形蟲在宿主內(nèi)生存和長(zhǎng)期持續(xù)存在所必須的Th1細(xì)胞極化免疫反應(yīng)。在以中樞神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼組織肌肉中出現(xiàn)包囊為特征的慢性感染的情況下，產(chǎn)生干擾素-γ的CD4 +和CD8 +T淋巴細(xì)胞必須保持靜態(tài)感染。闡明這種認(rèn)識(shí)的最顯著的證據(jù)來自于艾滋病，在該病的發(fā)展過程中，由于T細(xì)胞數(shù)量的減少，包囊可能能重新被激活，將產(chǎn)生災(zāi)難性后果。

過去20年間的研究，已經(jīng)證實(shí)了 IL -12作為一個(gè)早期細(xì)胞因子的重要性，其刺激免疫系統(tǒng)發(fā)展極化Th1反應(yīng)以便于控制弓形蟲。在IL-12缺乏的情況下，小鼠由于過量的寄生蟲感染和大量組織的破壞而快速發(fā)病。IL-12的產(chǎn)生允許宿主呈慢性感染而存活。在弓形蟲感染期間，樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12顯著增加，其次巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞也產(chǎn)生這種細(xì)胞因子。這些類型的細(xì)胞在體內(nèi)感染過程中是入侵靶向細(xì)胞，但是否感染細(xì)胞本身被觸發(fā)而產(chǎn)生IL-12或是否細(xì)胞因子是由未感染細(xì)胞對(duì)寄生蟲產(chǎn)物做出反應(yīng)而產(chǎn)生的，目前尚不清楚。不僅如此，顯而易見的是，IL-12的產(chǎn)生必須被嚴(yán)密的控制以防止產(chǎn)生炎性病理反應(yīng)。弓形蟲感染中，IL-10是一個(gè)關(guān)鍵的表達(dá)量下調(diào)的細(xì)胞因子。這樣，IL-10基因敲除小鼠的感染的動(dòng)態(tài)過程非常類似于IL-12和IFN-γ基因缺失的動(dòng)物。然而，IL-10缺失動(dòng)物的死亡是與較低數(shù)量的寄生蟲感染和IL-12、TNF-α和IFN-γ顯著高表達(dá)相關(guān)的。然而，過去認(rèn)為IL-10主要由細(xì)胞巨噬細(xì)胞系產(chǎn)生，最近的研究證實(shí)弓形蟲感染過程中，Th1細(xì)胞本身是IL-10的重要來源。

在弓形蟲和其他的微生物感染過程中，這些復(fù)雜的但必要的反應(yīng)是如何被激活的，一直是研究者長(zhǎng)期以來想弄清楚的興趣所在。上世紀(jì)八十年代，Janeway提出了先天免疫的細(xì)胞用模式識(shí)別受體（PRRs）對(duì)病原體相關(guān)（PAMPs）分子模式做出反應(yīng)的觀念。10年后，Janeway和Medzhitov發(fā)現(xiàn)一個(gè)主要的PRR家族蛋白，即Toll樣受體（TLR）。盡管TLRs在結(jié)構(gòu)上類似，但它們?cè)谧R(shí)別多樣性的微生物分子，包括蛋白、脂類，DNA和RNA分子上是顯著不同的。微生物配體觸發(fā)的Toll樣受體在激發(fā)對(duì)包括弓形蟲在內(nèi)的許多種微生物的免疫起著重要的作用。

二、依賴MyD88的Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)在防御弓形蟲上的重要性

關(guān)于Toll樣受體及其配體的早期研究主要聚焦于細(xì)菌和病毒分子，如脂多糖和核酸的識(shí)別，但很快就發(fā)現(xiàn)TLRs在原蟲的識(shí)別中也起著關(guān)鍵作用，可以激發(fā)宿主對(duì)這類病原體的免疫作用。MyD88基因敲除小鼠的研究首先證實(shí)了TLR在抵抗弓形蟲中的重要性。MyD88分子是一種常見的TLR信號(hào)適配器，這是因?yàn)閹缀跛械腡LRs使用此分子在宿主細(xì)胞傳遞信號(hào)。因此，MyD88基因的滅活導(dǎo)致了幾乎所有的TLR信號(hào)的損失。TLR3和TLR4是一個(gè)例外，它使用另一種接頭分子稱為包含適配器-誘導(dǎo)干擾素（TRIF）的Toll-IL-1受體域。在腹腔注射的小鼠模型中，用正常低毒力的ME49寄生蟲蟲株感染的情況下，MyD88的缺失導(dǎo)致小鼠的快速死亡。死亡率與高寄生蟲數(shù)量和低水平的IL-12和干擾素-γ相關(guān)。此外，在MyD88的缺失的情況下，中性粒細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)也缺失，其影響因素在其他使用這種小鼠品系的傳染性疾病模型中已有報(bào)道。

表1 TLR/MyD88基因敲除小鼠研究進(jìn)展概況

最近發(fā)現(xiàn)，通過口服途徑感染弓形蟲的動(dòng)物，在MyD88缺失情況下，對(duì)弓形蟲的易感性增加。MyD88最常見的功能是與先天免疫細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)，但有證據(jù)表明，獲得性免疫也使用這種常見的接頭分子。因此，骨髓嵌合體小鼠的研究表明，在慢性感染過程中，MyD88的T細(xì)胞表達(dá)對(duì)于防止出現(xiàn)弓形蟲腦炎是必須的。雖然MyD88基因敲除小鼠對(duì)弓形蟲的易感性表明TLR不僅識(shí)別寄生蟲，該接頭分子通過受體如IL-1和IL-18參與了信號(hào)傳導(dǎo)。然而，缺乏能產(chǎn)生有生物活性的IL-1和 IL-18的 IL-1β轉(zhuǎn)化酶（ICE）的小鼠，表現(xiàn)出正常的抗感染。這也是一重要的成果，因?yàn)樗峁┝擞辛Φ淖C據(jù)表明在抗弓形蟲感染中，需要TLR信號(hào)本身的參與。

雖然來自MyD88-/-小鼠的的研究結(jié)果證實(shí)了它們的重要性，但目前還沒有證據(jù)證實(shí)控制弓形蟲的免疫反應(yīng)的主要Toll樣受體。隨著進(jìn)一步研究，已經(jīng)鑒別出一種和小鼠TLR11受體作用的寄生蟲配體。相對(duì)于MyD88基因敲除的小鼠，缺乏這種基因的小鼠在易感性上僅略有增加。類似地，也有報(bào)道說TLR2-/-小鼠也顯示了對(duì)弓形蟲的易感性增高，但這種影響只出現(xiàn)在用高接種量的情況下。在對(duì)TLR2-/-小鼠的研究中，動(dòng)物感染后能夠存活，但阻止了小鼠大腦中包囊數(shù)量的增加。

另一項(xiàng)研究表明，雖然不同的研究結(jié)果有區(qū)別，但TLR4的缺乏增加了腸道感染的易感性。鑒于這種真核細(xì)胞病原體的分子復(fù)雜性，認(rèn)為弓形蟲擁有多種Toll樣受體配體是合理的，以至于任何單一配體的敲除對(duì)寄主抗性僅有輕微的影響（表1）。在宿主抗錐蟲和結(jié)核分枝桿菌的研究中也得到類似的結(jié)論，其中TLR2和TLR9的結(jié)合提供了對(duì)感染的最佳免疫力。

三、寄生蟲的TLR配體

目前，已確定了兩種弓形蟲TLR 配體的分子結(jié)構(gòu)。速殖子表面均勻覆蓋著糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白。弓形蟲磷脂錨定蛋白以及核心聚糖和脂基的純化，以及隨后的編碼TLR和NFκB報(bào)告基因的質(zhì)粒的細(xì)胞共轉(zhuǎn)染刺激，揭示磷脂基激發(fā)TLR2和TLR4。在巨噬細(xì)胞，這會(huì)導(dǎo)致TNF-α的產(chǎn)生和主要組織相容性Ⅱ類分子的上調(diào)。有趣的是，分離自弓形蟲的不飽和脂肪酸阻斷了腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)磷脂基團(tuán)特性。這可能與活蟲體不誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α，而且在脂多糖-TLR4的激發(fā)過程中有效抑制其合成的觀察相關(guān)。

迄今為止，磷脂基最接近作為真實(shí)的原生動(dòng)物PAMP分子。這樣，除了那些來自弓形蟲的磷脂基，來自布氏錐蟲、克氏錐蟲、利什曼原蟲、屬原蟲和瘧原蟲的磷脂基都具有TLR2或TLR4的激活特性。在一些蟲種（原蟲和錐蟲屬）中，這有助于提升保護(hù)性反應(yīng)，但在其他的一些蟲種中，這可能是致病的潛在原因（瘧原蟲）。為什么寄生蟲磷脂激活TLR而哺乳動(dòng)物磷脂不會(huì)觸發(fā)自身免疫反應(yīng)，可能與在這些寄生蟲的表面GPI蛋白大量的表達(dá)和這些分子結(jié)構(gòu)的特異性因蟲種的不同而變化等相關(guān)。

眾所周知，通過超聲裂解并高速離心后獲得的寄生蟲可溶性裂解液（STAg）能夠以一種依賴MyD88的方式刺激樹突狀細(xì)胞 IL-12的產(chǎn)生。裂解液中直接的生化分析導(dǎo)致了profilin的發(fā)現(xiàn)，其作為弓形蟲的MyD88的依賴IL-12的誘導(dǎo)分子起作用。有趣的是，于此同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了在艾美耳球蟲中具有IL-12誘導(dǎo)性能的profilin分子。然而，并非所有的頂復(fù)器原蟲都具備誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-12的能力，惡性瘧原蟲profilin僅具有很微弱的誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-12的能力。弓形蟲的TLR11被認(rèn)為是profilin的宿主細(xì)胞受體。在小鼠體內(nèi)表達(dá)，而人類體內(nèi)不表達(dá)的TLR11 分子，起初被認(rèn)為與腎盂腎炎細(xì)菌反應(yīng)，但迄今為止弓形蟲profilin是唯一被認(rèn)定作為TLR11受體配體的這種分子。除了誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的IL-12合成外，在弓形蟲的入侵過程中也需要profilin，揭示了profilin在寄生蟲-宿主相互作用中的雙重作用。profilin不是一種分泌分子，而是在速殖子細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)。這表明，IL-12的引發(fā)可能是由那些對(duì)蟲體降解物產(chǎn)生反應(yīng)而不是對(duì)感染本事作用的細(xì)胞介導(dǎo)的。

TLR/MyD88途徑被認(rèn)為在控制T細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)方面發(fā)揮了重要作用。這是因?yàn)閷Ｂ毧乖岢始?xì)胞如樹突狀細(xì)胞可以同時(shí)處理和提呈抗原，同時(shí)以依賴于MyD88的方式上調(diào)T細(xì)胞共刺激分子的表達(dá)。在這種模型的支持下，表明在同一個(gè)樹突狀細(xì)胞群中，STAg的腹腔注射誘導(dǎo)的針對(duì)profilin的CD4+ T細(xì)胞反應(yīng)是獨(dú)立于TLR11表達(dá)和主要組織相容II類識(shí)別的。

四、TLR/MyD88在腸道中的作用，那一個(gè)是前驅(qū)者？

目前已經(jīng)公認(rèn)，在高劑量弓形蟲感染時(shí)，某些近交系小鼠如C57BL/6株小鼠，出現(xiàn)嚴(yán)重的由炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的小腸病變。在低劑量感染情況下，IL-10預(yù)防這種病變的關(guān)鍵作用在IL-10-/-小鼠已得到證實(shí)。類似的腸道病變?cè)谄渌腥竟蜗x的動(dòng)物物種也有報(bào)道，但這種情況在人身上能否發(fā)生，尚不清楚。C57BL/6小鼠上的病變?cè)趲追矫骖愃朴谌说目肆_恩病，這種病目前認(rèn)為涉及腸道黏膜Th1細(xì)胞和Th17的錯(cuò)調(diào)反應(yīng)。正如人類的炎性腸炎，其病變與腸道中微生物的變化相關(guān)。是否這些變化是病變的結(jié)果或誘導(dǎo)因素，目前是一個(gè)研究的熱點(diǎn)。

在高劑量弓形蟲感染過程中，革蘭氏陰性細(xì)菌積累在腸道損傷的位。有趣的是，不僅TLR4和TLR9基因敲除小鼠對(duì)寄生蟲引起的腸道黏膜損傷有抗性，而且這與前炎癥細(xì)胞因子水平下降有關(guān)。此外，腸道菌群被廣譜抗生素破壞的小鼠具有耐弓形蟲引起的回腸損害的作用。以上結(jié)果表明以TLR為基礎(chǔ)的細(xì)菌識(shí)別，而不是寄生蟲感應(yīng)本身，引起了腸道黏膜炎癥病變。

最近的證據(jù)還表明，在低劑量弓形蟲感染條件下，內(nèi)源性腸道微生物對(duì)寄生蟲有免疫佐劑的作用。這樣，TLR11基因敲除小鼠，雖然無法對(duì)IL-12誘導(dǎo)TGPRF分子做出反應(yīng)，但可以在腸道感染過程中發(fā)展了健全的Th1反應(yīng)。然而，在TLR2x4-/ -和TLR9-/-小鼠，與保護(hù)相關(guān)的Th1細(xì)胞是缺失的。無菌小鼠弓形蟲感染導(dǎo)致在腸道黏膜IL-12反應(yīng)的缺陷，但如果用TLR4的配體脂多糖飼喂小鼠，這種反應(yīng)能夠恢復(fù)，進(jìn)一步支持了這些結(jié)果。因此，在口服引起弓形蟲感染時(shí)，蟲體表達(dá)的TLR配體可能沒有腸道粘膜表達(dá)的TLR配體作用大。根據(jù)這種觀點(diǎn)，弓形蟲感染會(huì)引起腸道的局部損傷，可能是寄生蟲的入侵和細(xì)胞裂解特性的結(jié)果。在低劑量感染條件下，這允許將細(xì)菌易位，促進(jìn)Th1細(xì)胞保護(hù)性分化，但高劑量感染條件下，將導(dǎo)致暴發(fā)性病變。然而，有趣的是，有報(bào)道說TLR11-/-小鼠可以抵抗寄生蟲誘導(dǎo)的腸道病變，這個(gè)結(jié)果暗示了弓形蟲TGPRF的作用，以及TLR4和TLR9對(duì)腸道炎癥的作用（見表1）。

五、無MyD88參與的免疫識(shí)別和免疫保護(hù)作用

雖然Toll樣受體和MyD88依賴的信號(hào)在宿主對(duì)弓形蟲的反應(yīng)是很重要的，但它并不是唯一途徑。在骨髓來源的巨噬細(xì)胞的體外感染過程中，細(xì)胞產(chǎn)生獨(dú)立MyD88信號(hào)的IL-12。有趣的是，這種作用具有寄生蟲株特異性，因?yàn)檎T導(dǎo)產(chǎn)生低水平的IL-12的生產(chǎn)的高毒力I型蟲體病不依賴于MyD88，而誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IL-12的低毒力II型蟲體需部分依賴于MyD88。IL-12的產(chǎn)量控制與ROP16有關(guān)系，ROP16是一種通過介導(dǎo)影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子的棒狀體激酶。

在腸道感染中，發(fā)現(xiàn)MyD88-/-的動(dòng)物由于寄生蟲復(fù)制的失控和傳播而出現(xiàn)一致的死亡率。不過，雖然Th1細(xì)胞出現(xiàn)有一定的延誤，但產(chǎn)生干擾素-γ的Th1細(xì)胞在感染后的一周作用達(dá)到正常水平。推測(cè)在這種情形下，雖然對(duì)于控制寄生蟲來說需要MyD88，但MyD88對(duì)于誘導(dǎo)產(chǎn)生獲得性免疫反應(yīng)并不是必不可少的。有可能在無MyD88的情況下，免疫誘導(dǎo)是由細(xì)菌識(shí)別系統(tǒng)諸如并沒參與TLR/MyD88信號(hào)途徑的NOD2或非基于Toll樣受體的寄生蟲自身識(shí)別已經(jīng)可以充分誘使延遲反應(yīng)。

為了搞清楚這些問題，檢驗(yàn)MyD88的基因敲除小鼠是否能產(chǎn)生保護(hù)性功能反應(yīng)，我們用無毒尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株即cps1寄生蟲- 1免疫小鼠，用RH株的毒力株攻毒。在這種情況下，寄生蟲特異的Th1細(xì)胞的出現(xiàn)誘導(dǎo)了免疫反應(yīng)，并證實(shí)了以前的預(yù)測(cè)，即動(dòng)物對(duì)致命的攻毒具有一定的抵抗能力。因此，這似乎是一個(gè)弓形蟲不依賴于MyD88的識(shí)別導(dǎo)致了具完全功能的適應(yīng)性免疫。

不依賴于TLR/MyD88弓形蟲識(shí)別的分子基礎(chǔ)目前尚不清楚。但是，這種寄生蟲引發(fā)的Gi-蛋白和GiPCR，導(dǎo)致一些包括CCL17和CCL22在內(nèi)的趨化因子的釋放。一個(gè)特別的趨化因子受體，CCR5，與IL-12的產(chǎn)生相關(guān)。如上所述，弓形蟲在入侵過程中激活STAT3和STAT6。這個(gè)過程的精確機(jī)制目前尚不清楚，但這些轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化并不需要MyD88（Butcher和Denkers，未出版）。

六、人TLR在抗弓形蟲中的重要性

在小鼠體內(nèi)廣泛的研究已表明了TLR/MyD88通路在抗病毒、細(xì)菌，真菌和原生動(dòng)物感染中的重要性。然而，這一途徑在人類宿主防御的作用尚不明確。一個(gè)MyD88遺傳性連續(xù)缺陷9代的患兒被發(fā)現(xiàn)對(duì)化膿性細(xì)菌易感，但出乎意料的對(duì)于包括弓形蟲在內(nèi)的其他感染具有抗性。這樣，相對(duì)于這一信號(hào)通路在小鼠抗感染中的重大影響，TLR/MyD88可能在人類宿主防御可能發(fā)揮較小的作用。但是，另一種解釋是，MyD88的缺失導(dǎo)致在感染早期致命的敏感性，以至于，患者根本無法被用于研究。對(duì)于弓形蟲感染的特定案例，人類TLR11的缺乏表達(dá)被認(rèn)為寄生蟲profilin不是IL-12的主要誘導(dǎo)因素。不過，用人的TLR2，CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染后會(huì)對(duì)速殖子磷脂分子衍生物產(chǎn)生反應(yīng)，表明TLR2可能在人的感染過程中發(fā)揮作用。因此，TLR/MyD88在人類的抗弓形蟲和其他感染的過程中的作用仍然是一個(gè)懸而未決的問題。

原作：Eric Y.Denkers康奈爾大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室

（略）