靜脈注射小劑量obestatin對(duì)大鼠胰腺外分泌的影響*

孫學(xué)成 廖 專 李兆申

第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化科1（200433） 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化科2

ghrelin和obestatin是一對(duì)來(lái)源于同一前體基因preproghrelin的重要肽類激素，經(jīng)不同翻譯后修飾，與不同受體結(jié)合，發(fā)揮生理學(xué)作用。ghrelin由28個(gè)氨基酸組成，能促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌，具有刺激攝食、誘導(dǎo)脂肪合成、增加體質(zhì)量等正向能量代謝調(diào)節(jié)作用；此外，ghrelin還可刺激胃酸分泌和胃動(dòng)力，抑制膽囊收縮素-8（CCK-8）刺激引起的胰腺外分泌增加[1]。obestatin由23個(gè)氨基酸組成，最初研究發(fā)現(xiàn)其具有與ghrelin相拮抗的生理學(xué)功能，是一種食欲抑制激素[2]。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠胰腺外分泌模型，旨在觀察靜脈注射小劑量obestatin對(duì)大鼠胰腺外分泌以及CCK-8刺激引起的胰腺外分泌增加的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

2～3月齡健康雄性清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠24只，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前大鼠于同一實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)1周：恒定溫度和濕度，標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水，每天8:00-20:00予日光燈照射模擬晝夜循環(huán)。

大鼠 obestatin （Phoenix Pharmaceuticals,Inc.）使用前以0.9%NaCl配制成1 nmol/ml和5 nmol/ml的溶液，分裝，－20℃保存；大鼠CCK-8（康肽生物科技北京有限公司）使用前以含1%胎牛血清的0.9%NaCl配制成400 pmol/ml的溶液；BCA蛋白測(cè)定試劑盒（BCA Protein Assay Kit,Pierce Protein Research Products,Thermo Fisher Scientific Inc.）。

二、方法

24 只大鼠隨機(jī)分為三組，分別為 1 nmol·kg-1·h-1obestatin+CCK-8 組（A 組）、5 nmol·kg-1·h-1obestatin+CCK-8（B 組）和 CCK-8組（C 組），每組 8只。 實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，所有實(shí)驗(yàn)均于9∶00開(kāi)始。

于安靜、無(wú)菌條件下予大鼠3%戊巴比妥鈉15 mg/300 g腹腔內(nèi)麻醉，分別于右側(cè)股靜脈和尾靜脈留置靜脈導(dǎo)管；腹部正中線切口，將Intima-Ⅱ靜脈留置針自十二指腸乳頭對(duì)側(cè)腸壁經(jīng)十二指腸乳頭開(kāi)口插入膽胰管，見(jiàn)黃色膽胰混合液（pancreaticbiliary juice,P-BJ）順暢流出后固定；于十二指腸乳頭上方插入Intima-Ⅱ靜脈留置針，用以回輸P-BJ。紅外線烤燈照射使大鼠肛溫維持于37℃左右，穩(wěn)定30 min后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。每15 min經(jīng)膽胰管插管收集一次P-BJ，以微量進(jìn)樣器測(cè)定體積后留取50μl，雙蒸水稀釋，參照BCA蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白含量。由于膽汁中蛋白含量很低，因此P-BJ中蛋白含量的變化可以反映胰液蛋白分泌量，單位時(shí)間內(nèi)胰液蛋白分泌量為該時(shí)段P-BJ體積與測(cè)得的蛋白含量的乘積。其余部分P-BJ于下一收集時(shí)段內(nèi)經(jīng)乳頭上方留置導(dǎo)管以2 ml/h的速率回輸至十二指腸內(nèi)。

將第一次收集的P-BJ作為基礎(chǔ)胰腺分泌，然后A、B組大鼠以微量注射泵經(jīng)尾靜脈持續(xù)注射obestatin 直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束（1 nmol·kg-1·h-1和 5 nmol·kg-1·h-1），收集 2 次 P-BJ后（30 min 后），再經(jīng)股靜脈持續(xù)注射 CCK-8直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束（400 pmol·kg-1·h-1[1]），收集6次P-BJ。C組大鼠僅經(jīng)股靜脈注射400 pmol·kg-1·h-1CCK-8 作為對(duì)照，注射時(shí)間同 A、B組。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、靜脈注射小劑量obestatin對(duì)P-BJ體積的影響

大鼠基礎(chǔ)胰腺分泌量為（136±44）μl/15 min。A、B組尾靜脈內(nèi)注射 obestatin 15 min和30 min后，單位時(shí)間內(nèi)P-BJ體積與基礎(chǔ)值相比無(wú)明顯差異。股靜脈內(nèi)注射CCK-815 min后，三組P-BJ體積均開(kāi)始升高，于注射后30 min或45 min達(dá)高峰，隨后緩慢下降，各時(shí)點(diǎn)與基礎(chǔ)值相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A、B組各時(shí)點(diǎn)單位時(shí)間內(nèi)P-BJ體積與同時(shí)點(diǎn)C組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖1）。

圖1 靜脈注射小劑量obestatin對(duì)P-BJ體積的影響

二、靜脈注射小劑量obestatin對(duì)胰液蛋白分泌的影響

大鼠基礎(chǔ)胰液蛋白分泌量為（11.9±2.2）mg/15 min。A、B組尾靜脈內(nèi)注射obestatin 15 min和30 min后，單位時(shí)間內(nèi)胰液蛋白分泌量與基礎(chǔ)值相比無(wú)明顯差異。股靜脈內(nèi)注射CCK-815 min后，三組胰液蛋白分泌量均開(kāi)始升高，于注射后45 min達(dá)高峰，隨后緩慢下降，各時(shí)點(diǎn)與基礎(chǔ)值相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A、B組各時(shí)點(diǎn)單位時(shí)間內(nèi)胰液蛋白分泌量與同時(shí)點(diǎn)C組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖 2）。

圖2 靜脈注射小劑量obestatin對(duì)胰液蛋白分泌的影響

討 論

作為ghrelin的相關(guān)肽，obestatin自發(fā)現(xiàn)以來(lái)即成為研究熱點(diǎn)，對(duì)于其生理學(xué)功能存在較多爭(zhēng)議。obestatin的發(fā)現(xiàn)者Zhang等[2]報(bào)道，obestatin能抑制攝食和胃腸功能。外源性obestatin腹腔內(nèi)注射能時(shí)間和劑量依賴性地抑制小鼠攝食量，腦室內(nèi)注射亦能抑制攝食量；此外，obestatin還能抑制體質(zhì)量增加，持續(xù)抑制胃排空活動(dòng)，降低空腸肌收縮能力，對(duì)體外培養(yǎng)大鼠垂體細(xì)胞的生長(zhǎng)激素分泌無(wú)明顯影響。雖然一些研究小組證實(shí)了obestatin對(duì)攝食和體質(zhì)量增加的抑制作用[3,4]，但亦有實(shí)驗(yàn)未能觀察到外源性obestatin對(duì)攝食和胃腸動(dòng)力的影響，對(duì)ghrelin刺激攝食和胃腸動(dòng)力的作用亦無(wú)拮抗效應(yīng)[5～7]，或發(fā)現(xiàn)外源性obestatin本身不能調(diào)節(jié)攝食，但能抑制外源性ghrelin的促進(jìn)食欲和刺激生長(zhǎng)激素分泌作用[8]。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，雖然ghrelin與obestatin的分泌節(jié)律均呈搏動(dòng)性，但兩者的血漿水平并不顯著相關(guān)，空腹24 h后ghrelin水平顯著升高而obestatin水平僅輕微降低；在某些病理狀態(tài)下如胃旁路術(shù)后，兩者水平的變化亦不一致[9]。關(guān)于obestatin的爭(zhēng)議還在于其受體。obestatin的發(fā)現(xiàn)者Zhang等[2]報(bào)道其受體為G蛋白偶聯(lián)受體GPR39，這一發(fā)現(xiàn)經(jīng)使用GPR39基因敲除小鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)[10]。但隨后三項(xiàng)通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)表達(dá)GPR39的實(shí)驗(yàn)均未能重復(fù)Zhang等[2]的研究結(jié)果[5,11,12]，且有研究[11,13]發(fā)現(xiàn)obestatin的可能中樞靶器官垂體和下丘腦中并無(wú)GPR39表達(dá)。

研究[1]發(fā)現(xiàn)ghrelin雖可抑制CCK-8刺激引起的胰腺外分泌增加，但對(duì)基礎(chǔ)胰腺分泌量、基礎(chǔ)胰液蛋白分泌和基礎(chǔ)淀粉酶分泌均無(wú)明顯影響。Kapica等[14]則發(fā)現(xiàn)大劑量外源性 obestatin（30、100、300 nmol/kg）可增加麻醉大鼠的胰液蛋白分泌和胰蛋白酶活性。上述研究結(jié)果并不符合obestatin與ghrelin作用“對(duì)立”的理論。Qader等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin和obestatin均能抑制胰島細(xì)胞分泌對(duì)胰腺分泌具有抑制作用的胰多肽和生長(zhǎng)抑素。因此關(guān)于外源性obestatin對(duì)胰腺外分泌的影響，目前仍無(wú)定論。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠胰腺外分泌模型，對(duì)此作了進(jìn)一步的研究。

根據(jù)Kapica等[14]的研究結(jié)果，經(jīng)靜脈給予obestatin 15 min后胰液蛋白分泌即顯著增加，并于30 min時(shí)達(dá)高峰，加之obestatin的血漿半衰期甚短，僅約22 min，因此本實(shí)驗(yàn)采用持續(xù)靜脈內(nèi)給藥方式，使obestatin起效更快，血藥濃度更穩(wěn)定。由于obestatin在1～5 nmol/kg的劑量范圍內(nèi)即可抑制空腸肌收縮[2]，而大鼠體內(nèi)obestatin的生理濃度遠(yuǎn)低于此劑量[16]，因此本實(shí)驗(yàn)obestatin的劑量選用 1 nmol·kg-1·h-1和 5 nmol·kg-1·h-1。De Spiegeleer等[17]的研究表明，造成obestatin功能研究結(jié)論分歧的原因?yàn)椋醋圆煌瑥S商的obestatin，純度和質(zhì)量存在差異。本實(shí)驗(yàn)選用Ren等[18]的研究中使用的obestatin，該研究小組關(guān)于外源性obestatin對(duì)大鼠胰島素分泌影響的研究得出陽(yáng)性結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示靜脈注射CCK-8可刺激大鼠的胰液和胰液蛋白分泌，而靜脈注射小劑量（1 nmol·kg-1·h-1和 5 nmol·kg-1·h-1）obestatin 對(duì) 胰腺外分泌無(wú)明顯影響，亦不能改變由CCK-8刺激引起的胰腺外分泌增加，與本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果（obestatin不影響胰腺腺泡和胰腺小葉的淀粉酶分泌）一致。胰腺外分泌系由神經(jīng)、體液因素組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控，而本實(shí)驗(yàn)又存在一定局限性，因此根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍無(wú)法確定obestatin的藥理學(xué)作用。與Kapica等[14]的研究相比，本實(shí)驗(yàn)選用的obestatin劑量較小，因此不能推斷其他劑量對(duì)胰腺外分泌無(wú)影響。Zhang等[2]研究obestatin對(duì)胃腸功能的影響時(shí)采用腹腔給藥，而本實(shí)驗(yàn)則采用靜脈給藥，給藥方式亦可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。而且，目前尚不清楚obestatin是否對(duì)胰腺外分泌具有雙向調(diào)節(jié)作用。綜上所述，靜脈注射小劑量obestatin對(duì)大鼠胰腺外分泌無(wú)明顯影響，且不能改變由CCK-8刺激引起的胰腺外分泌增加。今后尚需擴(kuò)大obestatin的劑量范圍并采用不同給藥方式，對(duì)該結(jié)果作進(jìn)一步論證。

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