黃芪多糖對(duì)TNF-α誘導(dǎo)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子基因轉(zhuǎn)錄及p38MAPK信號(hào)通路的影響

劉 蓓 朱海燕 高永紅 徐 冰 朱陵群 陳立新

(1北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市東城區(qū)海運(yùn)倉(cāng)5號(hào)，100700;2北京師范大學(xué)中藥資源與資源藥物研究所;3北京中醫(yī)藥大學(xué))

機(jī)體在正常情況下，中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞幾乎不產(chǎn)生黏附作用，在前炎癥因子刺激后，兩者黏附增加，從而對(duì)血管內(nèi)皮造成嚴(yán)重傷害。黃芪多糖是中藥黃芪的主要活性物質(zhì)，前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，并且對(duì)心肌缺血再灌注損傷引發(fā)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)具有一定的抑制作用［1］。本研究從基因轉(zhuǎn)錄水平觀察黃芪多糖干預(yù)TNF-α誘導(dǎo)的HCEMC中P-選擇素、E-選擇素轉(zhuǎn)錄的影響，同時(shí)觀察p38MAPK信號(hào)通路的變化，進(jìn)一步探討黃芪多糖干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥黏附作用的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 原代人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Scien-Cell)，從人心肌組織中分離后立即凍存，用抗Ⅷ因子、抗CD31(P-CAM)抗體(免疫熒光法)和DiI-Ac-LDL攝取檢測(cè)，均符合內(nèi)皮細(xì)胞特性。

1.1.2 主要藥品及試劑 黃芪多糖(天津賽諾制藥有限公司，批號(hào):Z20040086)、多聚賴氨酸(Sigma)、95%乙醇(北京試劑公司);內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(Scien-Cell);0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2～7.4)、虎紅(Solarbio);TNF- α(10μg，Peprotech)、SV Total RNA分離純化試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)、PCR Master Mix(ABI)。

1.1.3 主要儀器 CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Sanyo);Mx3000P熒光定量PCR儀(Stratagene);倒置相差顯微鏡(Olympus IMT-2);超凈工作臺(tái)(CJT-E-11北京昌平長(zhǎng)城空氣凈化工程公司);電熱恒溫水箱(HH.W21.420)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 將細(xì)胞凍存管從液氮中取出立即于37℃恒溫水浴箱中融化，注入預(yù)先用20mg/L多聚賴氨酸包被的75cm培養(yǎng)瓶中，使用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，放置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中，2～3天傳代1次，實(shí)驗(yàn)使用第5代細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 觀察細(xì)胞培養(yǎng)至80%融合，每組給予相應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)分組:1)正常對(duì)照組:細(xì)胞不加任何干預(yù);2)TNF-α組:加入終濃度為10μg/L的TNF-α;3)APS低劑量組:APS(25μg/mL)預(yù)孵育1h，加入終濃度為10μg/L的TNF-α;4)APS高劑量組:APS(100μg/mL)預(yù)孵育1h，加入終濃度為 10μg/L的 TNF-α;5)SB203580組:SB203580(10μg/L)預(yù)孵育1h后吸棄液體，加入終濃度為10μg/L的TNF-α。

1.2.3 總RNA提取 細(xì)胞總RNA提取嚴(yán)格按照SV Total RNA分離純化試劑盒操作步驟進(jìn)行。提取的總RNA用核酸蛋白分析儀測(cè) OD260、OD280，計(jì)算總RNA純度，OD260/OD280比值在1.7～2.0之間。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

1.2.4.1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明配制反轉(zhuǎn)錄體系:MgCl24μL，10×反轉(zhuǎn)錄 buffer 2μL，RNase Inhibitor 0.5μL，0ligdT-Adaptor Primer 1μL，dNTP Mixture 2μL，AMV Reverse Transcriptase 0.6μL。RNA 模板9.9μL(含1μg)，總體積:20μL。反應(yīng)條件:42℃ 30min，然后95℃ 5min。合成的cDNA以無(wú)RNA酶水稀釋5倍，置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR NCBI查人P-選擇素、E-選擇素、p38MAPK、β-actin引物序列，以設(shè)計(jì)軟件Premier5.0自動(dòng)設(shè)計(jì)，β-actin為內(nèi)參。引物合成由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。P-選擇素:Forward 5＇-TTC AGGACA ATGGACAGCAGT-3＇，Reverse 5＇-GTC CCA CCC ATT ATC AGA CCT-3 ＇，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度306bp;E-選擇素:Forward 5＇-GCA CAT CTC AGG GAC AAT GGA-3 ＇，Reverse5 ＇-TTG GAC TCA GTG GGA GCT TCA-3 ＇，擴(kuò) 增 片 段 長(zhǎng) 度238bp;p38MAPK:Forward 5＇-GCC GAA GAT GAA CTT TGC GA-3 ＇，Reverse5 ＇-GTG GTG GCA CAA AGC TGA TG-3＇，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 260bp;β -actin:Forward5 ＇-TCC TCC CTG GAG AAG AGC TA-3 ＇，Reverse 5＇-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3＇，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度302bp。

反應(yīng)體系:PCR master mix 12.5μL，上游引物1μL(10μmol/L)，下游引物 1μL(10umol/L)，cDNA5μL，RNAse Free Water 5.5μL，總體積:25μL。實(shí)時(shí)定量PCR儀反應(yīng)條件:95℃10min預(yù)變性，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40次循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線與融解曲線。根據(jù)計(jì)算機(jī)生成CT值，應(yīng)用2-△△CT法求出初始cDNA的相對(duì)量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料采用ˉx±s表示，各組之間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，TNF-α組P-選擇素、E-選擇素、p38MAPK基因表達(dá)明顯增加(P＜0.01);與 TNF-α組比較，黃芪多糖各劑量組、SB203580組P-選擇素、E-選擇素、p38MAPK基因表達(dá)均顯著降低(P＜0.01)。(見表1)

3 討論

TNF-α是由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞炎性因子，能夠促發(fā)炎癥反應(yīng)，并加重心肌缺血再灌注損傷。冠心病不穩(wěn)定心絞痛和心肌梗死患者血清中TNF-α的濃度都有明顯升高［2-3］。研究認(rèn)為，炎癥組織釋放TNF-α激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，隨后發(fā)生的基因表達(dá)被認(rèn)為是心肌缺血再灌注損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［4-5］。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞黏附分子中的選擇素家族與心肌缺血再灌注損傷關(guān)系密切，通過降低血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，干預(yù)細(xì)胞的黏附能力，能夠?qū)θ毖募∑鸬奖Ｗo(hù)作用。

黃芪性甘溫，歸脾、肺二經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)，益氣固表，利水消腫，托瘡生肌等功效。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黃芪能夠通過抑制NO生成、激活抗氧化酶和抑制心肌細(xì)胞凋亡，以及抑制某些炎癥因子的生成等作用，保護(hù)缺血心肌再灌注損傷［6］。中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子發(fā)生的相互作用與心肌缺血再灌注損傷有緊密聯(lián)系［7-8］。機(jī)體在心肌缺血再灌注和炎癥反應(yīng)的條件下，中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附增加，繼而損傷血管內(nèi)皮。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用TNF-α刺激心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞，并觀察其中黏附分子的基因轉(zhuǎn)錄變化與黃芪多糖的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃芪多糖能夠降低炎癥因子TNF-α刺激作用下心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞P-選擇素、E-選擇素的基因轉(zhuǎn)錄，提示黃芪多糖有可能部分阻斷細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，從而對(duì)心臟缺血再灌注起保護(hù)作用。

表1 黃芪多糖對(duì)TNF-α介導(dǎo)人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞P-選擇素、E-選擇素及p38MAPK mRNA表達(dá)的影響(ˉx±s，n=9)

我們前期的研究中已發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能夠減少人微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再損傷模型核因子-κB(NF-κB)的基因表達(dá)，進(jìn)而抑制再灌注損傷中部分黏附分子的表達(dá)［9］。而p38MAPK是機(jī)體內(nèi)另一條重要的炎癥信號(hào)通路，參與了機(jī)體的多種炎癥反應(yīng)，與心、腦、腎的缺血再灌注損傷有密切關(guān)系［10-11］，并且與NF-κB信號(hào)通路存在復(fù)雜的交叉對(duì)話關(guān)系［12］。Shimizu等［13］對(duì)心肌梗死大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血能夠激活p38MAPK通路，繼而伴隨的是NF-κB基因的表達(dá)增加，認(rèn)為p38MAPK與NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制與心肌缺血密切相關(guān)，阻斷p38MAPK信號(hào)通路能夠明顯減輕心肌缺血再灌注損傷［14-15］。通過本研究我們發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖和p38MAPK抑制劑SB203580能夠明顯改善由TNF-α誘導(dǎo)的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并能減少在前炎癥因子TNF-α刺激作用下人微血管內(nèi)皮細(xì)胞p38MAPK基因表達(dá)。結(jié)合既往研究結(jié)果我們推測(cè)，黃芪多糖除了能抑制NF-κB信號(hào)通路，還能干預(yù)p38MAPK信號(hào)通路，從而通過多條途徑抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗心肌再灌注損傷的作用。鑒于信號(hào)通路的復(fù)雜性，黃芪多糖的具體干預(yù)位點(diǎn)還不明確，這一結(jié)果有可能是黃芪多糖通過抑制p38MAPK信號(hào)通路，直接下調(diào)黏附分子的表達(dá);也可能是影響NF-κB通路后，間接下調(diào)黏附分子;或者兩種可能同時(shí)存在。具體機(jī)制有待更進(jìn)一步深入研究，同時(shí)需要從蛋白表達(dá)方面進(jìn)行驗(yàn)證。

［1］張灼，陳立新，宋崇順，等.黃芪多糖對(duì)大鼠心肌缺血-再灌注損傷后的保護(hù)作用.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2007，14(2):33-34.

［2］楊平，抗永倫，溫先勇，等.冠心病患者炎癥標(biāo)志物檢測(cè)的臨床意義.醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2007，20(1):9-12.

［3］Mizia-Stec K，Gasior Z，Zahorska-Markiewicz B，et al.Serum tumour necrosis factor-alpha，interleukin-2 and interleukin-10 activation in stable angina and acute coronary syndromes.Coron Artery Dis，2003，14(6):431-438.

［4］Michael Buerke，Diethard Pruefer，Dennis Sankat，et al.Effects of Aprotinin on Gene Expression and Protein Synthesis After Ischemia and Reperfusion in Rats.Circulation，2007，116:I 121-126.

［5］Jones SP，Trocha SD，Stranqe MB，et al.Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules in a chronic murine model of myocardial reperfusion injury.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2000，279(5):H2196-2201.

［6］劉靜，郭穎.黃芪注射液對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用.錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，27(3):34-36.

［7］A.Ramachandran，S.Jha，D.J.Lefer，et al.Pathophysiology of Myocardial Reperfusion Injury:The Role of Genetically Engineered Mouse Models.Veterinary Pathology，2008，45(5):698-706.

［8］Jeong Ryul Lee，Jae Jin Han，Jeong Wook Seo，et al.Correlation between ICAM-1 and functional recovery of piglet myocardium with leukocyte-depleted reperfusion.Surg，2000，70:1531-1535.

［9］朱海燕，陳立新，朱陵群.黃芪多糖對(duì)缺氧再?gòu)?fù)氧后人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1表達(dá)的影響.遼寧中醫(yī)雜志，2008，35(2):293-295.

［10］孫立倩，景曉彬，崔建忠.SB203580對(duì)IR鼠模型腦組織中神經(jīng)元凋亡的影響.山東醫(yī)藥，2009，49(2):34-36.

［11］Moolman JA，Hartley S，Van Wyk J，et al.Inhibition of myocardial apoptosis by ischemic and beta-adrenergic preconditioning is dependent on p38MAPK.Cardiovasc Drug Ther，2006，20(1):13-25.

［12］Li J，Lang MJ，Mao XB，et al.Antiapoptosis and mitochondrial effect of pioglitazone preconditioning in the ischemic/reperfused heart of rat.Cardiovasc Drugs Ther，2008，22(4):283-291.

［13］Shimizu N，Yoshiyama M，Omura T.Activation of mitogen-activated protein kinases and activator protein-1 in myocardial infarction in rats.Cardiovasc Res，1998 ，38(1):116-124.

［14］Gorog DA，Jabr RI，Tanno M，et al.MAPK-2 modulates p38MAPK localization and small heat shock protein phosphorylation but does not mediate the injury associated with p38MAPK activation during myocardial ischemia.Cell Stress Chaperones，2009，14(5):477-489.

［15］Lochner A，Marais E，Genade S，et al.Protection of the ischemic heart:investi-gations into the phenomenon of ischemic precondition.Cardiovasc JAfr，2009，20(1):43-51.