細(xì)菌內(nèi)毒素法檢查銀杏葉提取物注射液的熱原

劉 肅

(廣州市藥品檢驗(yàn)所,廣東 廣州 510610)

銀杏葉提取物注射液(商品名:金納多)屬心腦血管擴(kuò)張藥,每支含有銀杏葉提取物17.5mg,其中銀杏黃酮甙4.2μ g。銀杏總黃酮具有擴(kuò)張冠脈血管、腦血管,改善腦缺血產(chǎn)生的癥狀和記憶功能,對(duì)治療冠心病、腦動(dòng)脈硬化、老年性癡呆等病有一定的療效。

金納多的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了熱原檢查項(xiàng)目,未收錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)目。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查具有靈敏度高、檢測(cè)范圍相對(duì)較窄(革蘭氏陰性菌代謝產(chǎn)物)而熱原檢查檢測(cè)范圍廣(所有致熱原物質(zhì))、靈敏度低等特點(diǎn)。我們?cè)趯?duì)金納多的熱原檢測(cè)基礎(chǔ)上做干擾試驗(yàn),并與家兔法進(jìn)行了比較,以尋找一種簡(jiǎn)易可行、準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方法。

1 儀器與試藥

TW12六孔恒溫水浴(Julabo公司);MSI旋渦混合器(廣州IKA公司)。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(規(guī)格:每支120EU,批號(hào):150601-200699)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水 ,規(guī)格:每支 50mL,批號(hào):1007161)及鱟試劑(TAL)A(規(guī)格:每支 0.1mL,批號(hào):1005071,靈敏度:0.25 EU?mL-1)購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司;TAL B(廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司,規(guī)格:每支0.1mL,批號(hào):100101,靈敏度:0.25 EU?mL-1);金納多,臺(tái)灣濟(jì)生化學(xué)制藥廠股份有限公司,批號(hào):EB156,EB108,EB095。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)的確定

本品熱原檢查劑量M=1mL?kg-1,人用每公斤體重每小時(shí)可接受的內(nèi)毒素劑量K=5EU?kg-1,按公式L=K/M=5EU?mL-1,即為金納多的內(nèi)毒素檢查限度。

2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

按照2010年版《中國(guó)藥典》(二部)附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定,進(jìn)行鱟試劑的標(biāo)示靈敏度(λ)復(fù)核。結(jié)果見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果

由表1可見,兩批鱟試劑經(jīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品檢查,λ c均在0.5λ～2.0λ之間,結(jié)果均符合規(guī)定。

2.3 干擾預(yù)試驗(yàn)

目前用于藥品檢驗(yàn)的市售鱟試劑靈敏度(λ)一般在0.25 EU?mL-1～0.03 EU?mL-1之間,故金納多進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)時(shí),最大稀釋倍數(shù)MVD=CL/λ,分別為 20倍、40倍、80倍、160倍(L=5 EU?mL-1)。取3批金納多,用BET水將供試品稀釋20倍、40倍、80倍、160倍共4個(gè)濃度梯度的溶液,將此系列濃度溶液標(biāo)記為供試品管(NPC系列)。用上述稀釋液作為溶劑,溶解并稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品,制得每個(gè)稀釋度中細(xì)菌內(nèi)毒素含量均為2λ(0.5 EU?mL-1和0.25 EU?mL-1)的金納多溶液,標(biāo)記此系列溶液為供試品陽(yáng)性對(duì)照管(PPC系列)。取靈敏度為0.25 EU?mL-1的兩個(gè)不同廠家的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn),每一稀釋度做2管,同時(shí)按常規(guī)分別設(shè)細(xì)菌內(nèi)毒素陽(yáng)性對(duì)照(PC)和檢查用水陰性對(duì)照(NC)各2管,結(jié)果見表2。

表2 供試品干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

從表2結(jié)果可見,所用的3批金納多稀釋20倍或更大倍數(shù)時(shí),對(duì)兩個(gè)廠家的鱟試劑反應(yīng)無(wú)增強(qiáng)或抑制的干擾作用。

2.4 正式干擾試驗(yàn)

用兩個(gè)廠家的鱟試劑(靈敏度為0.25EU?mL-1),按中國(guó)藥典2010年版二部附錄的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行試驗(yàn),測(cè)定用BET水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值(Es)和用供試品稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值(Et)。取3批金納多,分別用BET水稀釋20倍,用BET水和供試品稀釋液分別將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成 2λ、1λ、0.5λ、0.25λ濃度,每一稀釋濃度重復(fù)4管,同時(shí)用上述供試品稀釋液和BET水各做2管陰性對(duì)照管,按公式計(jì)算BET水和供試品稀釋液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值(Es和Et),Es=lg-1(∑Xs/4),Et=lg-1(∑Xt/4),結(jié)果見表3。

表3 供試品(稀釋20倍)干擾試驗(yàn)結(jié)果

從表3結(jié)果可見,2λ、1λ管均為陽(yáng)性,0.5λ、0.25λ管均為陰性,對(duì)于λ=0.25EU?mL-1的2組鱟試劑的Es為0.25 EU?mL-1,3批金納多測(cè)得的Et和Es的比值均在0.5～2.0之間,說(shuō)明金納多在稀釋20倍或更大倍數(shù)時(shí)對(duì)兩個(gè)不同廠家的鱟試劑反應(yīng)無(wú)干擾作用,符合中國(guó)藥典2010年二部對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有效性的規(guī)定,因此可以確定金納多的最大無(wú)干擾濃度為稀釋20倍。

2.5 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取3批金納多,分別根據(jù)“2.4”項(xiàng)下方法制成供試品稀釋液,使用λ=0.25EU?mL-1的兩個(gè)廠家的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查,按中國(guó)藥典2010年版二部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢查,結(jié)果見表4。

表4 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

從表4結(jié)果可見,陰性對(duì)照管(NC)均為陰性,供試品陽(yáng)性對(duì)照管(PPC)和陽(yáng)性對(duì)照管(PC)均為陽(yáng)性,實(shí)驗(yàn)有效;供試品管(NPC)均為陰性,表明樣品中未檢出細(xì)菌內(nèi)毒素,3批金納多的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定。

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法因其具有靈敏度高、快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn),目前已被各國(guó)藥典所采納,作為替代熱原檢查法的一種檢測(cè)方法用于控制藥品的質(zhì)量。不同廠家的鱟試劑由于生產(chǎn)工藝、質(zhì)量參數(shù)等方面有一定差異,其抗干擾能力存在差異。因此,本實(shí)驗(yàn)采用兩個(gè)不同廠家不同靈敏度的鱟試劑對(duì)3個(gè)批號(hào)的樣品進(jìn)行試驗(yàn)。從正式干擾試驗(yàn)結(jié)果可見,樣品稀釋20倍時(shí),Es/Et均在 0.5～2.0范圍之內(nèi),可認(rèn)為金納多在該濃度下不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。用兩個(gè)廠家鱟試劑與3批樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查,樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素限量均在 5EU?mL-1限值以下,符合規(guī)定,這與熱原檢查的結(jié)果也是一致的。因此,銀杏葉提取物注射液采用限值5EU?mL-1進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法代替熱原檢查法是可行的。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].二部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄99.