大孔樹脂對中華常春藤總皂苷的純化研究

孔令強(qiáng)，劉 明，周 英

（貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

常春藤為五加科常春藤［Hedera nepalensis K.Koch.var.sinensis（Tobler）Rehder.］的干燥藤莖、葉［1］，常綠攀援藤本。常春藤屬植物莖含鞣質(zhì)、樹脂、皂苷、肌醇、胡蘿卜素等。常春藤屬植物中被研究最多，而且發(fā)現(xiàn)種類較多的一類成分就是皂苷類化合物。該類化合物具有保肝、抗腫瘤、止痙、止痛、殺蟲等多種藥理活性［2］。童星等［3］利用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定了常春藤揮發(fā)油的化學(xué)成分及其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，國外研究人員分別從臺灣常春藤、英國常春藤、尼泊爾常春藤中成功分離鑒別出8種齊墩果烷類皂苷7種木栓果烷類皂苷［4］－［6］，目前常春藤中所含齊墩果烷型皂苷hederacolchiside A1等被證實(shí)有較強(qiáng)的抗癌活性［7］。本實(shí)驗(yàn)選擇兩種樹脂（AB－8、D101）對常春藤中皂苷的純化進(jìn)行研究，以期獲得皂苷含量較高的部分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中華常春藤干燥莖，購于河北安國冷背中藥材市場；常春藤皂苷C，Sigma公司；AB－8、D101型大孔樹脂，南開大學(xué)化工廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；TU－1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FA2004電子分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；GZX－9140MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博達(dá)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理

將大孔吸附樹脂浸泡在95%乙醇中24h，待其充分溶脹后，用乙醇反復(fù)清洗至流出液加適量蒸餾水無混濁，再用蒸餾水洗盡乙醇，樹脂濕法裝柱后，用2%HCl溶液沖洗，蒸餾水洗至中性后再用5%NaOH溶液沖洗，用水沖洗至中性，樹脂備用。

1.2.2 樣品的制備方法

稱取100g常春藤干燥莖，粉碎后以70%乙醇作溶劑，按固液比1∶15加入乙醇，浸泡2h后在50℃水浴中提取2次，每次3h，合并提取液，減壓過濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至密度為1.20，將產(chǎn)物依次用石油醚、正丁醇萃取后濃縮并干燥，用甲醇溶解，定容到50mL容量瓶中，即得待測液。

1.2.3 大孔吸附樹脂對常春藤的靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)

（1）靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)。

取常春藤總皂苷制備液（2.00mg／mL）50mL裝入錐形瓶中，分別加入2種型號的樹脂各1g，室溫置于搖床上振蕩6h。將充分吸附后的樹脂過濾，置于50mL錐形瓶中，再用70%的乙醇解吸，室溫置于搖床上振蕩6h，測定吸附前后樣液的總皂苷濃度，選出吸附率和解吸率都好的樹脂。按式（1）、式（2）計(jì)算樹脂吸附率和解吸率。

其中：A為吸附率（%）、B為解吸率（%）；C0為起始濃度、C1為平衡濃度、C2為解吸液濃度（mg／mL）；V1為吸附液體積、V2為解吸液體積（mL）。

（2）靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線。

稱取10.0gAB－8濕樹脂于500mL錐形瓶中，加入總皂苷濃度為2.00mg／mL的樣液200mL，室溫置于搖床上，震蕩12h，每小時(shí)定時(shí)取樣2.5mL，測定吸附余液總皂苷的濃度，計(jì)算吸附率。

1.2.4 大孔樹脂對常春藤總皂苷的動態(tài)吸附和解吸

將預(yù)處理好的AB－8樹脂濕法裝入（1cm×40cm）玻璃層析柱中，將常春藤總皂苷提取液上柱，對上樣流速、濃度、洗脫液濃度及流速等進(jìn)行動態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中待樣液全部通過樹脂柱后，用去離子水洗至流出液無色，再用不同濃度的乙醇以一定速度洗脫，收集洗脫液，測定總皂苷含量。

1.2.5 中華常春藤總皂苷的測定方法

采用常春藤皂苷C為對照品香草醛－濃硫酸顯色法。

（1）試劑的配制。

①常春藤皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液（50μg／mL）：準(zhǔn)確稱取一定干燥至恒重的常春藤皂苷C標(biāo)準(zhǔn)品2.5mg，于20mL燒杯中，加入甲醇10mL，微熱使之溶解，用甲醇定容至50mL，搖勻并置于冰箱中保存；②8%香草醛溶液：準(zhǔn)確稱取無水香草醛8g于50mL燒杯中，加50mL蒸餾水溶解后，倒入100mL容量瓶中，定容至刻度，置于棕色瓶中并低溫保存；③77%硫酸溶液：準(zhǔn)確量取蒸餾水21mL于250mL燒杯中，緩慢加入98%H2SO479mL，靜置后倒入100mL容量瓶中并低溫保存。

（2）樣品的顯色測定法。

移取2mL待測液于比色管中，烘干溶液加入8%香草醛溶液0.10mL，1min后，加入77%硫酸3.00mL，搖勻，65℃水浴加熱10min，再冰水浴15min，各取1mL移入試管，用77%硫酸定容到10mL，搖勻，靜置10min后以試劑空白作參比，在440nm處測其吸光度。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

準(zhǔn)確量?。?0μg／mL）常春藤皂苷 C標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00于容量瓶中，其余操作同（2），以試劑空白作參比，在440nm處測其吸光度，結(jié)果見圖1，并以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，常春藤皂苷C濃度（μg／mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，求得回歸方程y＝0.0636x＋0.0108，R2＝0.9987。

圖1 常春藤皂苷C對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同樹脂對常春藤總皂苷的吸附率及解吸率

由圖2可以看出，AB－8樹脂具有較大的吸附率和解吸率，D101樹脂的吸附率相對較低，從綜合上考慮，本實(shí)驗(yàn)確定AB－8樹脂為實(shí)驗(yàn)用樹脂。

圖2 兩種大孔吸附樹脂的吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 AB－8樹脂對常春藤總皂苷的靜態(tài)吸附動力學(xué)特征

合適的吸附樹脂除了具有較大的吸附容量、吸附率和解吸率外，同時(shí)還要有較快的吸附速率。實(shí)驗(yàn)對AB－8樹脂進(jìn)行吸附動力學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖3所示。

圖3 AB－8樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

從圖3可以看出，AB－8樹脂對常春藤總皂苷的吸附為平衡型，在6h后基本到達(dá)平衡，到后期雖然有些緩慢下降趨勢，但是起始階段到中后期吸附量都較大，總體上看來，AB－8大孔樹脂對常春藤總皂苷具有良好的吸附動力學(xué)特征，綜合考慮，AB－8大孔樹脂對常春藤總皂苷具有良好的吸附解吸特性，適合常春藤總皂苷的分離純化。

2.1.3 吸附pH 的影響

不同pH條件對樹脂吸附常春藤總皂苷的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同pH值對常春藤總皂苷吸附率的影響

從圖4可以看出，pH對吸附率的影響在pH值0～3之間較為明顯，但在pH值3～7影響不明顯，且吸附率普遍較高，常春藤總皂苷提取液的自身濃度為7，在此條件下的吸附率也較高，考慮到實(shí)際操作難易，因此實(shí)驗(yàn)選擇提取液自身的pH條件。

2.2 AB－8大孔樹脂對常春藤總皂苷的動態(tài)吸附結(jié)果

2.2.1 上樣流速的影響

通過調(diào)節(jié)流速對上柱樣液進(jìn)行吸附流速的選擇，上樣濃度均為2mg／mL，制流速分別為1、2、3、4、5、6BV／h，進(jìn)行動態(tài)吸附，六種流速下的吸附率如圖5所示。

圖5 不同上樣速度對常春藤總皂苷吸附率的影響

由圖5可知，流速為1BV／h時(shí)吸附率最大，但是1BV／h的流速過慢，上樣時(shí)間長，導(dǎo)致循環(huán)周期延長，考慮到時(shí)間過長會影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度所以選擇3BV／h的流速比較合適。

治療前，兩組患者的UPDRS II和UPDRS III評分相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療后，兩組患者UPDRS II和UPDRS III評分均顯著降低，同組治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且觀察組患者UPDRS II和UPDRS III評分顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.2.2 上樣濃度的影響

通過調(diào)節(jié)上柱樣液濃度分別為1、2、3、4、5、6mg／mL，進(jìn)行吸附濃度的選擇，控制流速為3BV／h進(jìn)行動態(tài)吸附，6種吸附濃度下的吸附率如圖6所示。

圖6 不同上樣濃度對常春藤總皂苷吸附率的影響

由圖6可知，隨著上樣濃度的增加，吸附率在不斷增大，當(dāng)上樣濃度達(dá)到2BV／h時(shí)變化很小，且濃度越大越容易出現(xiàn)沉淀并導(dǎo)致柱層析的堵塞，所以選擇上樣濃度為2mg／mL比較合適。

2.2.3 洗脫液濃度的影響

分別用10%、30%、50%、70%、90% 的乙醇溶劑進(jìn)行洗脫，解吸流速控制為3BV／h，分別將各次洗脫的組分合并，然后測定它們的吸光度，計(jì)算解吸率，結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同乙醇濃度對常春藤總皂苷吸附率的影響

2.2.4 洗脫流速的影響

在確定洗脫劑的最佳濃度后，還需要對洗脫流速進(jìn)行確定，用70%的乙醇洗脫，控制流速分別為1、2、3、4、5、6BV／h，進(jìn)行動態(tài)解吸，六種洗脫流速下的解吸率如圖8所示。

圖8 不同洗脫速度對常春藤總皂苷吸附率的影響

由圖8可以看出，以1BV／h和2BV／h的流速進(jìn)行洗脫得到的解吸率均較高，考慮到循環(huán)周期問題，選擇流速較大的2BV／h為宜。

3 結(jié)論

通過對所選兩種樹脂對常春藤總皂苷的吸附與解吸性能的研究，確定AB－8樹脂為理想的常春藤總皂苷分離純化的樹脂，其吸附率為72.4%，解吸率為81%，吸附6h達(dá)到平衡。AB－8樹脂對常春藤總皂苷純化的最佳條件為：上柱液pH為7，上柱速度3BV／h，上樣濃度為2mg／mL，以30%乙醇為洗脫液控制洗脫液流速2BV／h。在此條件下，常春藤總皂苷的含量由2%提高到37%，說明AB－8樹脂可有效地分離純化常春藤總皂苷。

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