HPLC法測(cè)定當(dāng)歸芍藥散中芍藥苷、白芍苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I的含量

賀曉艷，宋秋月，鄭 丹，韓 力，黃學(xué)石

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 合成藥物與仿生藥物研究室，遼寧 沈陽(yáng) 110001）

當(dāng)歸芍藥散（DSS）源于東漢張仲景《金匱要略》，由當(dāng)歸、白芍、川芎、茯苓、白術(shù)和澤瀉6味中藥組成［1］，具有活血補(bǔ)血、健脾利濕的功效，長(zhǎng)久以來(lái)被用于治療婦科疾病［2］。上世紀(jì)80年代末，發(fā)現(xiàn)DSS具有保護(hù)神經(jīng)、治療神經(jīng)功能紊亂的作用，在日本DSS常被用于治療阿斯海默氏?。?］。筆者對(duì)DSS中的兩味中藥白芍、當(dāng)歸的化學(xué)成分研究表明，這兩味中藥中含量最大的4種成分分別是芍藥苷（5kg白芍中分離得到純品2.75g）、白芍苷（5kg白芍中分離得到純品1.47g）、阿魏酸（5kg當(dāng)歸中分離得到純品1.02g）和洋川芎內(nèi)酯I（5kg當(dāng)歸中分離得到純品356mg）。文獻(xiàn)報(bào)道白芍中的芍藥苷、白芍苷具有止痛、解痙、抗炎、抗凝血活性，當(dāng)歸中的酚酸、苯酞類化合物具有舒張血管、抗血栓、抗氧化、抗炎等活性［4］。這4種含量較大的化合物均為DSS中的活性成分，芍藥苷和阿魏酸在DSS中的含量測(cè)定已有文獻(xiàn)報(bào)道［5－7］，但白芍苷和洋川芎內(nèi)酯I在DSS及單味藥中的含量測(cè)定方法尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法建立測(cè)定DSS及單味藥中4種主要成分含量方法，以期為DSS及單味藥的質(zhì)量控制提供方法和依據(jù)。

1 儀器、試劑與材料

Waters 2695分析型高效液相色譜儀，Waters 2996 PDA檢測(cè)器，Empower色譜數(shù)據(jù)工作站，奧豪斯R2140型電子分析天平，奧豪斯ARA520型電子分析天平，KQ－500型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；乙腈為色譜純（sigma－aldrich），甲醇為色譜純（sigma－aldrich），水為制備純水，甲酸分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。藥材飲片均購(gòu)自遼寧省醫(yī)藥實(shí)業(yè)有限公司（生產(chǎn)企業(yè)：河北祁新中藥顆粒飲片有限公司），由沈陽(yáng)藥科大學(xué)路金才教授鑒定，分別為傘形科植物當(dāng)歸（Angelica sinensis）的干燥根（產(chǎn)地：甘肅，批號(hào)：20091124），毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora）的干燥根（產(chǎn)地：安徽，批號(hào)：20100515），傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong）的干燥根莖（產(chǎn)地：四川，批號(hào)：20091124），茯苓（Poria cocos）（產(chǎn)地：安徽，批號(hào)：20100515），菊科植物白術(shù)（Atractylodes macrocephala）的干燥根莖（產(chǎn)地：浙江，批號(hào)：20100515），澤瀉科植物澤瀉（Alisma orientalis）的干燥塊莖（產(chǎn)地：福建，批號(hào)：20100515）；對(duì)照品芍藥苷、白芍苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I均為本實(shí)驗(yàn)室自制，由ESI－MS、1H NMR、13C NMR實(shí)驗(yàn)確定結(jié)構(gòu)，HPLC檢測(cè)純度均＞95%。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

YMC C18色譜柱（4.6mm×150mm，5μm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相A：B＝8：92，測(cè)定芍藥苷（圖1A－1）和白芍苷（圖1A－2）；流動(dòng)相 A：B＝20：80，測(cè)定阿魏酸（圖1A－3）和洋川芎內(nèi)酯I（圖1A－4）；流速1.0mL·min－1，柱溫23.5℃，進(jìn)樣量20μL。檢測(cè)波長(zhǎng)200～400nm，數(shù)據(jù)處理選擇最大吸收波長(zhǎng)分別為232nm（芍藥苷、白芍苷）、280nm（洋川芎內(nèi)酯I）、322nm（阿魏酸）。供試品溶液色譜中與各對(duì)照品對(duì)應(yīng)的吸收峰的理論塔板數(shù)均不低于3000，對(duì)應(yīng)的色譜峰的分離度均＞2.0。

圖1 對(duì)照品及白芍、當(dāng)歸、川芎、DSS HPLC

2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取干燥至恒重芍藥苷、白芍苷對(duì)照品12.4、11.6mg，分別置于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度定容，搖勻，即得芍藥苷、白芍苷濃度分別為496、464μg·mL－1的對(duì)照品溶液。精密稱取干燥至恒重的洋川芎內(nèi)酯I和阿魏酸對(duì)照品25.3、25.7mg，分別置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度定容，搖勻，再分別吸取1.00mL洋川芎內(nèi)酯I和阿魏酸對(duì)照品溶液分別置于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度定容，搖勻，即得洋川芎內(nèi)酯I、阿魏酸濃度分別為101、103μg·mL－1對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

2.3.1 白芍、當(dāng)歸和川芎藥材供試品溶液制備

分別取白芍、當(dāng)歸和川芎藥材適量，粉碎，過(guò)80目篩，精密稱定白芍藥材粉末1.000g、當(dāng)歸藥材粉末0.500g、川芎藥材粉末0.500g，分別置于50mL容量瓶中，加75%甲醇45mL，超聲處理40min，放冷后加75%甲醇至刻度定容，搖勻，過(guò)濾，濾液用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 當(dāng)歸芍藥散供試品溶液制備

按當(dāng)歸芍藥散處方比例，精密稱取藥材粉末（過(guò)80目篩）：當(dāng)歸30.00g、白芍60.00g、茯苓40.00g、白術(shù)40.00g、澤瀉40.00g、川芎30.00g混合均勻，即得DSS。稱取配制好的DSS 4.000g，置于50mL容量瓶中，加75%甲醇約45mL，超聲處理40min，放冷后加75%甲醇至刻度定容，搖勻，過(guò)濾，濾液用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50mL分別置于5mL的容量瓶中，加甲醇至刻度定容，搖勻。精密吸取白芍苷對(duì)照品溶液1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50mL分別置于10mL的容量瓶中，加甲醇至刻度定容，搖勻。精密吸取洋川芎內(nèi)酯I對(duì)照品溶液1.00、2.50、1.00、1.00、1.50、2.00、2.50mL分別置于100、50、10、5、5、5、5mL的容量瓶中，加甲醇至刻度定容，搖勻。精密吸取阿魏酸對(duì)照品溶液1.00、2.50、1.00、1.50、2.00、2.50、1.50mL分別置于100、50、10、10、10、10、5mL的容量瓶中，加甲醇至刻度定容，搖勻。進(jìn)樣20μL，每份重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)表1。

表1 芍藥苷、白芍苷、洋川芎內(nèi)酯I、阿魏酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn)

芍藥苷、白芍苷、洋川芎內(nèi)酯I、阿魏酸對(duì)照品溶液，每份重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積RSD值，見(jiàn)表2，結(jié)果表明儀器精密度良好。

表2 芍藥苷、白芍苷、洋川芎內(nèi)酯I、阿魏酸的精密度

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

分別稱取藥材粉末（過(guò)80目篩）：白芍1.000g、當(dāng)歸0.500g、川芎0.500g各6份，當(dāng)歸芍藥散4.000g，12份。按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，每份供試品溶液測(cè)定3次取峰面積平均值。芍藥苷在白芍和當(dāng)歸芍藥散中含量的RSD值分別為0.61%、0.45%；白芍苷在白芍和當(dāng)歸芍藥散中含量的RSD值分別為1.9%、1.3%；洋川芎內(nèi)酯I在當(dāng)歸、川芎和當(dāng)歸芍藥散中含量的RSD值分別為1.9%、1.7%、1.9%；阿魏酸在當(dāng)歸、川芎和當(dāng)歸芍藥散中含量的RSD值分別為3.4%、5.0%、1.8%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別稱取藥材粉末（過(guò)80目篩）：白芍1.000g、當(dāng)歸0.500g、川芎0.500g，各1份，當(dāng)歸芍藥散4.000g，2份。按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測(cè)定，每份供試品溶液測(cè)定3次取峰面積平均值。芍藥苷在白芍和當(dāng)歸芍藥散中含量的RSD值分別為0.95%、0.42%；白芍苷在白芍和當(dāng)歸芍藥散中含量的RSD值分別為1.0%、1.2%；洋川芎內(nèi)酯I在當(dāng)歸、川芎和當(dāng)歸芍藥散中含量的RSD值分別為1.5%、0.6%、1.6%；阿魏酸在當(dāng)歸、川芎和當(dāng)歸芍藥散中含量的RSD值分別為3.3%、4.7%、1.9%。結(jié)果表明芍藥苷、白芍苷、洋川芎內(nèi)酯I、阿魏酸在供試品溶液中24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取同批白芍粉末1.000g，當(dāng)歸芍藥散粉末4.000g，各9份，分別置于50mL容量瓶中，分別加入高濃度的芍藥苷（1.70mg）、白芍苷（1.43mg）對(duì)照品，中濃 度的芍 藥苷（1.36mg）、白芍苷（1.00mg）對(duì)照品，低濃 度的芍 藥苷（1.02mg）、白芍苷（0.71mg）對(duì)照品各3份，按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明芍藥苷在白芍和當(dāng)歸芍藥散中的平均回收率分別為100.5%、100.9%，RSD為3.4%、2.0%；白芍苷在白芍和當(dāng)歸芍藥散中的平均回收率分別為102.7%、103.4%，RSD為3.0%、1.9%。

取同批當(dāng)歸粉末0.500g、川芎粉末0.500g，當(dāng)歸芍藥散粉末4.000g，各9份，分別置于50mL容量瓶中。分別向當(dāng)歸中加入洋川芎內(nèi)酯I 101μg·mL－1，0.90mL，阿魏酸103μg·mL－1，0.90mL，3份；洋川芎內(nèi)酯I 101μg·mL－1，0.60mL，阿魏酸103μg·mL－1，0.60mL，3份；洋川芎內(nèi)酯I 101μg·mL－1，0.30mL，阿魏酸103μg·mL－1，0.30mL，3份。分別向川芎中加入洋川芎內(nèi)酯I 101μg·mL－1，6.00mL，阿魏酸103μg·mL－1，5.40mL，3份；洋川芎內(nèi)酯I 101μg·mL－1，4.00mL，阿魏酸103μg·mL－1，3.60mL，3份；洋川芎內(nèi)酯I 101μg·mL－1，2.00mL，阿魏酸103μg·mL－1，1.80mL，3份。分別向 DSS中加入洋川芎內(nèi)酯I 101μg·mL－1，7.00mL，阿魏酸103μg·mL－1，5.80mL，3份；洋川芎內(nèi)酯I 101μg·mL－1，5.00mL，阿魏酸103μg·mL－1，4.00mL，3份；洋川芎內(nèi)酯I101μg·mL－1，2.50mL，阿魏酸103μg·mL－1，1.60mL，3份。按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明洋川芎內(nèi)酯I在當(dāng)歸、川芎和當(dāng)歸芍藥散中的平均回收率分別為99.2%、98.1%、99.2%，RSD為2.1%、2.1%、2.3%；阿魏酸在當(dāng)歸、川芎和當(dāng)歸芍藥散中的平均回收率分別為98.2%、99.0%、96.9%，RSD為2.8%、4.5%、2.5%；

2.9 樣品含量測(cè)定

分別稱取藥材粉末（過(guò)80目篩）：白芍1.000g、當(dāng)歸0.500g、川芎0.500g，各6份，當(dāng)歸芍藥散4.000g，12份。按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，每份供試品溶液測(cè)定3次取峰面積平均值。芍藥苷在白芍和當(dāng)歸芍藥散中含量分別為13.6mg·g－1、3.40mg·g－1，RSD為0.61%、0.45%；白芍苷在白芍和當(dāng)歸芍藥散中含量分別為4.84mg·g－1、1.21mg·g－1，RSD為1.9%、1.3%；洋川芎內(nèi)酯I在當(dāng)歸、川芎和當(dāng)歸芍藥散中含量分別為0.236mg·g－1、1.70mg·g－1、0.249mg·g－1，RSD為1.5%、0.6%、1.6%；阿魏酸在當(dāng)歸、川芎和當(dāng)歸芍藥散中含量分別為0.231mg·g－1、0.950mg·g－1、0.142mg·g－1，RSD 為 3.3%、4.7%、1.9%。

3 討論

3.1 提取方案的確定

實(shí)驗(yàn)中對(duì)供試品溶液的提取方法進(jìn)行了考察，分別用純甲醇、75%甲醇提取，75%甲醇提取芍藥苷、白芍苷和阿魏酸都要比純甲醇提取率高；洋川芎內(nèi)酯I在兩種溶劑中提取率相當(dāng)。超聲提取3次與超聲1次的提取效果沒(méi)有顯著變化，最終確定了上述提取方法。

3.2 流動(dòng)相的選擇

根據(jù)參考文獻(xiàn)［4］確定流動(dòng)相系統(tǒng)為乙腈－水（0.1%v／v甲酸）。改變乙腈：水（0.1%v／v甲酸）比例從35∶65至5∶95，本研究選擇乙腈：水（0.1%v／v甲酸）＝8∶92，該條件下白芍苷與芍藥苷達(dá)到基線分離。但應(yīng)用此條件時(shí)，阿魏酸t(yī)R＝60.2min，洋川芎內(nèi)酯I tR＝98.3min，阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯I保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、耗時(shí)太久，不能滿足建立快速分析方法的要求。因此，筆者選擇不同比例的流動(dòng)相分別來(lái)測(cè)定，選用乙腈：水（0.1%v／v甲酸）＝8∶92測(cè)定DSS和白芍中的芍藥苷和白芍苷，選用乙腈：水（0.1%v／v甲酸）＝20∶80測(cè)定DSS和當(dāng)歸、川芎中阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯I。

3.3 含量測(cè)定結(jié)果分析

筆者前期的化學(xué)成分研究表明，當(dāng)歸中含量最大的兩種成分為阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯I，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［8］，組成DSS的6味藥中，川芎中同樣含有阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯I。因此，本研究在測(cè)定DSS和當(dāng)歸中的阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯I含量的同時(shí)，也測(cè)定了川芎中這兩種成分的含量。結(jié)果表明，阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯I在川芎中的含量都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于當(dāng)歸，阿魏酸在川芎中的含量為當(dāng)歸中的4.11倍，洋川芎內(nèi)酯I在川芎中的含量為當(dāng)歸中的7.20倍。

研究結(jié)果表明，芍藥苷和白芍苷在白芍和含有等量白芍的DSS中的含量一致，阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯I在當(dāng)歸、川芎中的含量之和與含有等量當(dāng)歸、川芎的DSS中的含量一致，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)方案條件下，DSS中其他組分不干擾芍藥苷、白芍苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I的含量測(cè)定。

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