苦參中總黃酮提取工藝研究

盧麗萍，杜慧琴，張 蕾＊，廖瓊峰，歐立娟

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.上海藥港生物技術(shù)有限公司，上海 201203）

苦參為豆科槐屬植物苦參Sophora flavescens Ait的干燥根。具有清熱燥濕，殺蟲，利尿的功效，主治熱痢，便血，黃膽尿閉，赤白帶下，陰腫陰癢，濕疹，濕瘡，皮膚瘙癢，疥癬麻風(fēng)；外治滴蟲性陰道炎［1］?？鄥⒅饕猩飰A和黃酮兩大類化學(xué)成分，目前，國內(nèi)外對苦參的研究比較多，但大多集中在生物堿類成分，苦參黃酮類成分的研究較少，并且多集中在化學(xué)成分的分離分析和藥理作用上［2－6］，苦參總黃酮回流提取法的優(yōu)化工藝尚未見文獻(xiàn)報道。本研究通過單因素循環(huán)和正交試驗考察了回流提取法各因素對總黃酮溶出率的影響，確定了適用于工業(yè)大生產(chǎn)的苦參總黃酮最優(yōu)提取工藝，為合理開發(fā)和利用苦參資源提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

UV－2100型紫外可見分光光度計（上海龍尼柯儀器有限公司），GKC21CR4可控硅恒溫水浴鍋（上海錦屏儀器儀表有限公司），槐屬二氫黃酮 G對照品（自制，純度＞98.0%），其他試劑均為分析純。苦參藥材購自廣州致信藥業(yè)有限公司，由本院藥用植物學(xué)教研室周勁松老師鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦參中總黃酮含量的測定［7］

2.1.1 溶液的制備

（1）對照品溶液的制備。取槐屬二氫黃酮G對照品適量，精密稱定，用70%乙醇溶解并稀釋成每1mL含58μg槐屬二氫黃酮G的對照品溶液。

（2）供試品溶液的制備。取苦參藥材粉末（40目）約0.4g，精密稱定，按單因素實驗和正交實驗中不同的提取條件進(jìn)行回流提取，提取液經(jīng)濾紙濾過至50mL量瓶中，80%乙醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 顯色方法和測定波長

精密吸取供試品溶液、對照品溶液各1.0mL，置加有鎂粉300mg的具塞刻度試管中。將試管置冷水?。?5℃左右）中，緩慢滴加濃鹽酸3mL，并不時振搖試管。加70%乙醇補(bǔ)足至10mL，搖勻，置沸水浴中加熱60min，迅速冷卻至室溫，補(bǔ)足體積至10mL。在200～600nm范圍內(nèi)掃描吸收光譜，確定測定苦參總黃酮的檢測波長為478nm。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取槐屬二氫黃酮G對照品溶液0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0、5.0mL分別置6個加有鎂粉300mg的具塞刻度試管中。按鹽酸－鎂粉法顯色后，在478nm處測定吸光度。以對照品吸光度（Ai）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（Ci）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，槐屬二氫黃酮G在5.8～29.0μg／mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系，回歸方程為：A＝0.0262C－0.0049（n＝5，r＝0.9998）。

2.1.4 總黃酮含量的測定

精密吸取供試品溶液1.0mL，按“2.1.3”項下操作的方法測定吸光度，按外標(biāo)一點法計算總黃酮含量。

2.2 苦參總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素循環(huán)試驗

（1）乙醇體積分?jǐn)?shù)的考察。取苦參藥材粉末（40目）4份，每份約0.4g，精密稱定，分別于80℃水浴中，用10倍量30%，50%，70%，95%乙醇回流提取1.5h（×1次），按上述“2.1”項下方法測定總黃酮的含量。乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取的影響如圖1所示，結(jié)果表明，70%～95%乙醇體積分?jǐn)?shù)的提取效果較好。

（2）提取溫度的考察。取苦參藥材粉末（40目）4份，每份約0.4g，精密稱定，分別于60℃、70℃、80℃、90℃水浴中用20倍量70%乙醇回流提取1.5h（×1次），按上述2.1方法測定總黃酮的量。結(jié)果如圖1所示，水浴溫度80℃有利于苦參總黃酮的提取。

（3）提取時間的考察。取苦參藥材粉末（40目）5份，每份約0.4g，精密稱定，于80℃水浴中，用20倍量70%乙醇回流提取0.5h、1.0h、1.5h、2.0h 、3.0h（×1次），按上述“2.1”項方法測定總黃酮的量。結(jié)果如圖1所示，提取時間為1.0h時總黃酮的浸出量最高，再隨著提取時間的延長，總黃酮的浸出量略微下降。

（4）提取料液比的考察。取苦參藥材粉末（40目）4份，每份約0.4g，精密稱定，于80℃水浴中，分別用10倍量、20倍量、30倍量、40倍量70%乙醇回流提1.0h（×1次），按上述“2.1”方法測定總黃酮的量。結(jié)果如圖1所示，料液比1∶10～1∶40之間對總黃酮浸出率無明顯差異，最終選擇工業(yè)生產(chǎn)常用料液比1∶20。

（5）提取次數(shù)的考察。取苦參藥材粉末（40目）3份，每份約0.4g，精密稱定，于80℃水浴中，用20倍量70%乙醇分別回流提取1次、2次、3次，每次提取1.0h，按上述“2.1”項方法測定總黃酮的量。結(jié)果如圖1所示，料液比提取次數(shù)對總黃酮浸出率無明顯差異。

2.2.2 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，在80℃水浴中，用20倍量提取溶劑，以苦參中總黃酮含量作為評價指標(biāo)。設(shè)計如表1所示的因素水平進(jìn)行正交試驗，結(jié)果見表2和表3。

圖1 總黃酮單因素水平試驗結(jié)果

表1 因素水平

表2 正交試驗結(jié)果 （n＝3）

表3 方差分析結(jié)果

由表2可見各因素對苦參總黃酮含量的影響為A≈B＞C，最佳水平組合為A2B2C1。由表3的方差分析結(jié)果可見A和B因素的影響有顯著性意義，C因素則無顯著性影響。綜合直觀分析和方差分析結(jié)果，兼顧考慮縮短生產(chǎn)周期、減少能耗等因素，以A2B2C1為最佳提取工藝，即：用20倍量80%乙醇，80℃水浴中加熱回流提取1次，提取時間為1h。

2.2.3 最佳工藝的驗證

根據(jù)上述試驗得出的最佳工藝條件：乙醇濃度80%，提取溫度80℃，料液比1∶20，提取時間1.0h，提取次數(shù)1次。對其進(jìn)行驗證，平行進(jìn)行5樣本分析，測定苦參中總黃酮的含量（2.01±0.13）%。

3 討論

本試驗對苦參總黃酮回流提取工藝進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和提取溫度為影響其提取率的主要因素，而提取次數(shù)和溶劑倍數(shù)無顯著性影響。因而建議工業(yè)生產(chǎn)和植物化學(xué)研究領(lǐng)域，對于苦參的提取可以摒棄經(jīng)驗提取習(xí)慣（2h×2次）。本文優(yōu)化結(jié)果證明，以20倍量80%乙醇為提取溶劑，80℃控溫環(huán)境下，提取1h，僅需1次黃酮已基本提取完全。

本試驗選用正交實驗法優(yōu)化苦參總黃酮回流提取工藝的實驗條件，大大提高了總黃酮的提取效率，為苦參中黃酮類化合物的深入研究和苦參藥用成分的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：188－189.

［2］趙平，張穎君，山本浩文，等.苦參異戊烯基黃酮類化合物的化學(xué)活性及其生物合成研究進(jìn)展 ［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2004，26（2）：172－178.

［3］趙慧娟，孫文基.苦參中黃酮類化合物的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展［J］.中藥材，2005，28（3）：247－251.

［4］劉鵬飛，程愛卿，鄧天昇，等.苦參中總黃酮含量的測定及分布研究［J］.中成藥，2007，29（4）：596－598.

［5］劉斌，石任兵，周素蓉.苦參湯有效部位總黃酮含量測定方法研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2004，10（6）：24－26.

［6］張瑞菊，張國英，孫海波，等.微波輔助提取苦參總黃酮［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28（9）：43－46.

［7］盧麗萍，張蕾，廖瓊峰，等.苦參中總黃酮含量測定方法的研究［J］.今日藥學(xué)，2011，21（3）：146－148.