中國北方漢族男性血管內(nèi)皮生長因子受體2基因+4422（AC）n多態(tài)性與HiHiLo訓(xùn)練敏感性的關(guān)聯(lián)研究

聶晶 胡揚 王景玲 衣龍燕 烏云格日勒

1 江西師范大學(xué)（南昌 330022）

2 北京體育大學(xué)

3 山東省射擊射箭訓(xùn)練基地

4 內(nèi)蒙古師范大學(xué)

血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）是由美國學(xué)者Bruce等在1992年從人臍靜脈內(nèi)皮細胞cDNA文庫中應(yīng)用與已知受體酪氨酸激酶（RTK）同源引物通過PCR擴增而獲得[1]。它與VEGF結(jié)合后，通過引起自身胞內(nèi)激酶區(qū)特定酪氨酸自身磷酸化而活化，進而激活一系列下游信號分子，從而啟動核內(nèi)VEGF基因的表達，完成VEGF促血管內(nèi)皮細胞增殖、誘導(dǎo)新生血管形成等作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，有氧耐力運動均能上調(diào)VEGFR2 mRNA水平，且VEGFR2蛋白表達增加與耐力運動導(dǎo)致肌組織毛細血管增生高度相關(guān)[2-8]。還有文獻報道，VEGFR2 mRNA表達的顯著上調(diào)僅出現(xiàn)在耐力訓(xùn)練敏感組（即VO2max明顯提高）[9]。這些結(jié)果提示VEGFR2基因在有氧耐力運動中扮演了重要的角色，且mRNA表達的差異可能與基因多態(tài)性有關(guān)。

+4422（AC）n多態(tài)性位于人類VEGFR2基因第2內(nèi)含子上，其功能意義尚不清楚。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，該位點與某些病理表型有關(guān)聯(lián)，而且攜（AC）11等位基因者VEGFR2啟動子活性明顯強于攜（AC）12等位基因者，提示該多態(tài)可能是一個功能位點，會影響基因表達[10]。而能否利用該重復(fù)多態(tài)性來預(yù)測低氧訓(xùn)練效果，目前尚未見此方面的報道。本研究通過30天高住高練低訓(xùn)（HiHiLo），探討VEGFR2基因+4422（AC）n多態(tài)性與低氧訓(xùn)練敏感性的關(guān)聯(lián)，以期為解釋低氧訓(xùn)練效果的個體差異以及制定個性化的低氧訓(xùn)練方案提供科學(xué)依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

本研究選取71名中國北方漢族平原地區(qū)健康男性受試者，無低氧環(huán)境居住史，大多數(shù)來自北京體育大學(xué)體育系和運動系的中長跑、足球等耐力性項目專業(yè)，年齡21.10±1.37歲，身高177.93±5.26厘米，體重69.80±7.80公斤，運動年限4.29±2.12年。

1.2 實驗方法

1.2.1 低氧訓(xùn)練方案

HiHiLo方案：低氧睡眠+低氧訓(xùn)練+常氧專項訓(xùn)練，共30天。其中低氧睡眠7 d/周，每晚至少10 h（晚21:00～次日晨7:00），氧濃度為14.8%～14.3%（模擬海拔2800～3000 m）；低氧訓(xùn)練3次/周，低氧訓(xùn)練方式為常壓低氧環(huán)境（氧濃度為15.4%～14.8%，模擬海拔2500～2800 m）蹬功率自行車30 min（60 r/min），以個體75%VO2max強度為基礎(chǔ)，運動過程中調(diào)節(jié)功率車負荷，使受試者SpO2維持在87%～93%。其余時間在常氧環(huán)境下進行專項訓(xùn)練。

1.2.2 VO2max的測定

分別在HiHiLo前后測試1次。實驗方法為遞增負荷運動實驗，受試者以90W為起始負荷，以60轉(zhuǎn)/分的頻率蹬功率自行車，每2 min遞增30W。VO2max的判定標(biāo)準為HR超過180次/分，呼吸商超過1.1，耗氧量不再增加，不能繼續(xù)堅持運動。測試儀器為德國Cortex-MetalyzerⅡ型心肺功能測試系統(tǒng)。

1.2.3 脈搏血氧飽和度（SpO2）的測定

分別在HiHiLo前后VO2max測試結(jié)束后的第2天測定。測定采用的運動方式為低氧環(huán)境下（15.4%O2，海拔約2500米）蹬功率自行車，運動強度為HiHiLo前個體75%VO2max，轉(zhuǎn)速為60轉(zhuǎn)/分。測試時，先讓受試者坐功率車上安靜，待HR、SpO2穩(wěn)定后，開始采集安靜5分鐘每分鐘的SpO2值；然后以遞增負荷方式熱身5分鐘后間歇，等HR恢復(fù)至90～100次/分時，開始按規(guī)定負荷蹬功率車15分鐘，停止后恢復(fù)5分鐘（前2分半鐘反方向蹬，后2分半鐘轉(zhuǎn)為安靜）。記錄運動15分鐘和恢復(fù)5分鐘期間每分鐘的SpO2。測試儀器為美國產(chǎn)脈搏血氧飽和度測試儀（NONIN 8500）。

1.2.4 基因多態(tài)性分析

用Promega試劑盒提取全血DNA。采用PCR結(jié)合熒光標(biāo)記復(fù)合STR-genescan方法檢測（AC）n多態(tài)重復(fù)次數(shù)。+4422（AC）n多態(tài)性在NCBI的SNPs庫中，編號為rs3034659。參考NC_000004.10序列，應(yīng)用primer5.0自行設(shè)計引物，使用熒光標(biāo)記FAM標(biāo)記上游5’端。上引物：5’-FAM aag gct aat aca act ctt ca -3’（20bp）；下引物：5’-cag gtg gct gta ctg gtt-3’（18bp）。PCR 反應(yīng)體系（15 μl） ：DNA 模 板 0.5 μl，Taq 酶（0.15 μl，5 U/μl），dNTP（0.3 μl， 10 mM），Mg2+（0.9 μl，25 mM），上下引物各 1.5 μl（0.05 μg/μl），buffer 1.5 μl，滅菌雙蒸水補齊。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；變性94 ℃40 s，退火56 ℃40 s，延伸72℃40 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸15 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物使用ABI-377DNA分析儀確定片段長度，用genescan3.7軟件分析擴增產(chǎn)物，并對純合子進行測序鑒定其重復(fù)次數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用△（訓(xùn)練后－訓(xùn)練前）表示訓(xùn)練敏感性。所有數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計包完成。采用卡方檢驗和精確率檢驗受試者基因型頻率是否符合H-W平衡定律，以確認研究樣本的群體代表性；用K-S檢驗訓(xùn)練前后生理指標(biāo)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布；所有受試者低氧訓(xùn)練前后指標(biāo)的變化采用配對t檢驗；基因型之間各生理指標(biāo)的初始值采用獨立樣本t檢驗，訓(xùn)練敏感性采用協(xié)方差處理。顯著性水平設(shè)為P < 0.05，非常顯著性水平設(shè)為P < 0.01。

2 結(jié)果

2.1 VEGFR2基因+4422（AC）n多態(tài)性基因型和等位基因分布頻率

經(jīng)genescan3.7軟件分析后，VEGFR2基因+4422（AC）n多態(tài)性出現(xiàn)四種基因型，分別為（AC）11/（AC）11型43人，頻率為60.56%；（AC）11/（AC）12型21人，頻率為29.58%；（AC）12/ （AC）12型5人，頻率為7.04%；（AC）11/（AC）13型2人，頻率為2.82%。（AC）11等位基因頻率為76.76%，（AC）12等位基因頻率21.83%，（AC）13等位基因頻率1.41%。經(jīng)卡方檢驗，結(jié)果顯示：χ2（df=3）= 1.27，P = 0.74，表明該人群符合H-W平衡定律，具有群體代表性。

2.2 HiHiLo前后VO2max及定量負荷運動SpO2的變化

經(jīng)過30天HiHiLo ，68名受試者（3人由于測試有誤，數(shù)據(jù)被刪去）VO2max和rVO2max較訓(xùn)練前顯著性提高，分別增加了5.72±11.24%和6.81±11.22%；71名受試者定量負荷運動中和恢復(fù)期SpO2也較訓(xùn)練前顯著性升高，分別提高了1.45±1.87%和1.20±1.48%，安靜狀態(tài)下SpO2未出現(xiàn)顯著性變化（表1，圖1）。

表1 HiHiLo后VO2max及定量負荷下SpO2的變化

圖1 HiHiLo后定量負荷下SpO2的變化

2.3 HiHiLo后各基因型VO2 max的變化

由于（AC）12/（AC）12和（AC）11/（AC）13兩種基因型人數(shù)均≤5，以下各指標(biāo)只對（AC）11/（AC）11和（AC）11/（AC）12進行比較。表2顯示，HiHiLo前，各基因型的VO2max和rVO2max無顯著性差異；經(jīng)過30天HiHiLo ，（AC）11/（AC）11基因型rVO2max的訓(xùn)練敏感性顯著高于（AC）11/（AC）12基因型（P < 0.05）；且（AC）11/（AC）11基因型VO2max的訓(xùn)練敏感性也有高于（AC）11/（AC）12基因型的趨勢（P < 0.1）。

2.4 HiHiLo后各基因型定量負荷下SpO2的變化

表3顯示，不同基因型者在定量負荷運動下SpO2初始值無顯著差異；HiHiLo后，各基因型定量負荷運動下SpO2訓(xùn)練敏感性也未見顯著差異。

表2 HiHiLo后各基因型VO2max的變化

表3 HiHiLo后各基因型定量負荷下SpO2變化

3 討論

3.1 HiHiLo后運動能力的變化

本研究結(jié)果顯示，30天HiHiLo后，受試者VO2max的絕對值和相對值均較訓(xùn)練前顯著提高 （P < 0.01），分別增加了5.72±11.24%和6.81±11.22%，表明該訓(xùn)練方法明顯提高了機體有氧運動能力，這與Stray-Gundersen等學(xué)者的報道相一致[11]。但也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，4周HiHiLo后，運動員VO2max的提高并無統(tǒng)計學(xué)意義[12]。造成以上結(jié)果不同的原因可能與受試者個體差異、運動項目之間的差異、低氧環(huán)境以及訓(xùn)練方法的差異有關(guān)。

目前，對SpO2的監(jiān)測已被廣泛應(yīng)用于運動訓(xùn)練領(lǐng)域中，它在一定程度上可以反映機體缺氧的狀況。本研究發(fā)現(xiàn)，HiHiLo后，受試者在進行相同負荷運動中及運動后恢復(fù)期SpO2均較訓(xùn)練前顯著升高（P < 0.01），表明機體缺氧狀況明顯改善，運動能力有所提高。造成此結(jié)果的原因可能主要還是與低氧刺激有關(guān)。有文獻報道，間歇性低氧暴露后，在低氧安靜時以及低氧運動時SpO2較暴露前顯著增加[13，14]。

3.2 VEGFR2基因+4422（AC）n多態(tài)性與VO2 max、SpO2 的關(guān)聯(lián)

在低氧環(huán)境中，肌組織通過毛細血管新生，縮短血管與組織細胞之間的氧氣彌散距離，擴大彌散面積，增加對細胞的供氧量，這是機體在組織水平上對低氧習(xí)服適應(yīng)的重要機制。而VEGFR2在血管新生中發(fā)揮了重要作用[15，16]。有文獻報道，VEGFR2基因敲除的小鼠由于缺乏血管生成的能力而死亡[17]。因此，推測VEGFR2基因可能與低氧適應(yīng)能力有關(guān)。而這種適應(yīng)能力的好壞直接關(guān)系著訓(xùn)練的效果。迄今為止，人類基因組中已發(fā)現(xiàn)了一些與低氧適應(yīng)能力有關(guān)的基因多態(tài)性，但對微衛(wèi)星多態(tài)性的報道不多。該多態(tài)性又被稱為短串聯(lián)重復(fù)（STR），它們分布廣泛，且其重復(fù)次數(shù)在個體間呈高度變異性，因而，也是目前在遺傳分析中應(yīng)用最廣泛的遺傳標(biāo)記之一。

本研究首次報道了VEGFR2基因+4422（AC）n多態(tài)性與HiHiLo訓(xùn)練敏感性的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示，HiHiLo后，（AC）11/（AC）11基因型rVO2max訓(xùn)練敏感性顯著高于（AC）11/（AC）12基因型，且（AC）11/（AC）11基因型VO2max訓(xùn)練敏感性也有高于（AC）11/（AC）12基因型的趨勢；在完成同等負荷的低氧運動中，SpO2敏感性在不同基因型之間未出現(xiàn)顯著差異。這表明VEGFR2基因+4422（AC）n多態(tài)性與HiHiLo后rVO2max的變化有關(guān)聯(lián)，而與定量負荷運動下SpO2的變化無關(guān)聯(lián)。其中（AC）11/（AC）11基因型者對HiHiLo訓(xùn)練更敏感，提示該多態(tài)性可以用于預(yù)測低氧訓(xùn)練效果。分析其關(guān)聯(lián)原因可能是由于該多態(tài)位于內(nèi)含子上，而內(nèi)含子在基因剪切過程中發(fā)揮著重要的作用。尤其是靠近外顯子的內(nèi)含子區(qū)可能對于異源核RNA（hnRNA）→mRNA成熟過程中的選擇性拼接有重要影響。它通過參與5’端加帽、3’端加PolyA的形成，從而提高mRNA的穩(wěn)定性，提高基因表達的效率；而且在內(nèi)含子中還可能含有某些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，從而調(diào)控基因表達。另外，在特定情況下，內(nèi)含子也可以作為增強子或沉默子影響到基因的轉(zhuǎn)錄表達[18]。因此，（AC）11/（AC）11基因型者可能表現(xiàn)出較高的VEGFR2 mRNA表達，從而增強了與VEGF的結(jié)合活性，產(chǎn)生促血管生成的生物學(xué)效應(yīng)，有利于提高組織攝氧能力，導(dǎo)致機體VO2max增加。已有文獻報道，經(jīng)過6周耐力訓(xùn)練后，VEGFR2 mRNA僅在VO2max明顯升高組顯著上調(diào)[9]。這可能也進一步提示了VEGFR2基因表達的差異會影響有氧能力表型（VO2max），而基因多態(tài)性可以解釋這種個體差異。另一方面，該多態(tài)本身可能并不是功能位點，但與某個功能位點連鎖不平衡。近年來有文獻報道，VEGFR2基因的某些其他功能位點與臨床病理表型有關(guān)聯(lián)，可能是影響了 R2 與 VEGF 結(jié)合的有效性[19，20]。關(guān)于VEGFR2基因+4422（AC）n多態(tài)性與定量負荷低氧運動下SpO2變化無關(guān)聯(lián)，可能是該多態(tài)并不決定此表型。但我國學(xué)者鄭瀾等發(fā)現(xiàn)，血清VEGF含量與動脈血氧分壓顯著相關(guān)[21]。推測可能與VEGF受體活性有關(guān)。隨著低氧程度的增加，動脈血氧分壓下降，VEGF受體活性增強，與血清VEGF結(jié)合后，產(chǎn)生促血管生成效應(yīng)，而使血中VEGF含量下降，這將有利于機體缺氧狀況的改善。因此，從理論上分析VEGFR2可能與低氧訓(xùn)練后SpO2變化有一定聯(lián)系。但究竟本研究所選取的+4422（AC）n多態(tài)是不是功能位點，還需要進一步進行功能研究。而且，本研究中（AC）12/ （AC）12和（AC）11/（AC）13兩種基因型分布頻率偏低，因而有待于加大樣本量進行驗證。

另外，本研究也首次報道了VEGFR2基因+4422（AC）n多態(tài)性基因型及等位基因在中國北方漢族人群中的分布頻率。本結(jié)果與Kariyazono等報道該基因多態(tài)性在144名日本人中的分布頻率并不完全一致[10]。這可能與種族、地區(qū)的異質(zhì)性以及樣本量的大小有關(guān)，也有待于其它研究的進一步驗證。

4 總結(jié)

VEGFR2基因+4422（AC）n多態(tài)性與HiHiLo后rVO2max訓(xùn)練敏感性有關(guān)聯(lián)，而與定量負荷低氧運動下SpO2訓(xùn)練敏感性無關(guān)聯(lián)。其中（AC）11/（AC）11基因型者對HiHiLo更敏感，提示VEGFR2基因+4422（AC）n多態(tài)性可以作為預(yù)測低氧訓(xùn)練效果的分子遺傳學(xué)標(biāo)記，但還有待于加大樣本量進行驗證。

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