黑曲霉發(fā)酵豆粕對豆粕中酸溶蛋白含量影響的研究

朱平軍，程茂基，江 濤，邱良偉，關(guān)嬌嬌

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥 230036）

發(fā)酵豆粕是一種新型植物蛋白飼料原料，其以豆粕為主要原料，運用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)而成，與豆粕相比，發(fā)酵豆粕的抗?fàn)I養(yǎng)因子水平大為降低，營養(yǎng)水平和使用價值得到提高，應(yīng)用范圍也更加廣泛[1]。在發(fā)酵豆粕生產(chǎn)中，常使用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌、黑曲霉和米曲霉菌等一種或數(shù)種微生物菌種進行發(fā)酵，其中黑曲霉因為其獨特的性質(zhì)而受到特別青睞。黑曲霉具有產(chǎn)酶能力強、酶系豐富等特點，可以分泌植酸酶、蛋白酶、纖維素酶等多種消化酶，是經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)允許應(yīng)用在飼料中的益生菌之一[2-3]。

發(fā)酵豆粕質(zhì)量檢測的指標(biāo)包括感官指標(biāo)、常規(guī)指標(biāo)（灰分、氨基酸）、抗?fàn)I養(yǎng)因子去除程度和小分子蛋白的含量等。本試驗使用黑曲霉發(fā)酵豆粕，利用黑曲霉產(chǎn)生的蛋白酶等消化酶降解豆粕中的蛋白質(zhì)，使豆粕大分子蛋白降解為小分子蛋白、肽類和氨基酸等。為簡單起見，本試驗以黑曲霉發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白含量作為試驗測定指標(biāo)。

1 試驗材料

1.1 微生物菌株

黑曲霉益生菌株AN03為本實驗室選育保存（N+注入誘變選育的高產(chǎn)酸性蛋白酶菌株）。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基均為土豆培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基不加瓊脂。

1.3 試驗原料

豆粕購自合肥市場。

1.4 黑曲霉發(fā)酵種子液的制備

從新鮮黑曲霉斜面中挑取一環(huán)菌，接入裝有50mL液體土豆培養(yǎng)基和數(shù)粒玻璃珠的三角瓶中，120 rpm振蕩培養(yǎng)24 h。

2 試驗方法

2.1 酸溶蛋白含量的測定方法

參照大豆肽粉標(biāo)準(zhǔn)（QB/T 2653-2004）中酸溶蛋白質(zhì)含量的測定，準(zhǔn)確稱取樣品2.00 g，加入15%三氯乙酸（TCA）溶液10mL，混合均勻，靜置5min。將溶液定量轉(zhuǎn)移，在4 000 rpm下離心10min后，取全部上清液，按GB/T 14771-1993規(guī)定的方法測定上清液可溶蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)換算系數(shù)為6.25，測定結(jié)果根據(jù)樣品的干燥失重，折算為干基。

2.2 單因素檢測對黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響試驗

2.2.1 發(fā)酵時間

取30 g豆粕于自封袋中（開口發(fā)酵，下同），發(fā)酵溫度28℃，接種量6%，料水比1∶1，置于振蕩培養(yǎng)箱中，研究發(fā)酵時間0、24、48、72、96和120 h對豆粕中酸溶蛋白含量的影響。試驗分為6組，每組2個重復(fù)，每個重復(fù)2袋，下同。

2.2.2 發(fā)酵溫度

取30 g豆粕于自封袋中，發(fā)酵時間72 h，接種量6%，料水比1:1，置于振蕩培養(yǎng)箱中，研究發(fā)酵溫度26、27、28、29、30和31℃對豆粕中酸溶蛋白含量的影響。

2.2.3 接種量

取30 g豆粕于自封袋中，發(fā)酵時間72 h，發(fā)酵溫度28℃，料水比1∶1，置于振蕩培養(yǎng)箱中，研究接種量2%、4%、6%、8%、10%和12%對豆粕中酸溶蛋白含量的影響。

2.2.4 料水比

取30 g豆粕于自封袋中，發(fā)酵時間72 h，發(fā)酵溫度28℃，接種量6%，置于振蕩培養(yǎng)箱中，研究料水比1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8、1∶0.9、1∶1和1∶1.1對豆粕中酸溶蛋白含量的影響。

2.3 正交優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取單因素中對試驗指標(biāo)影響較大的試驗條件進行正交試驗，進一步優(yōu)化黑曲霉發(fā)酵豆粕的發(fā)酵條件。正交試驗每組設(shè)2個重復(fù)。

2.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用正交設(shè)計助手和SAS 9.1進行數(shù)據(jù)處理分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤標(biāo)示。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗對黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響

3.1.1 發(fā)酵時間

發(fā)酵時間對黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響見表1。

表1 發(fā)酵時間對黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響%

由表1可見，未發(fā)酵豆粕原料中酸溶蛋白含量僅有1.75%，黑曲霉發(fā)酵24 h后發(fā)酵產(chǎn)品中酸溶蛋白含量就達到9.63%，發(fā)酵96 h含量最高可達11.59%，隨發(fā)酵時間的延長酸溶蛋白含量又開始下降，原因是達到酸溶蛋白含量最高以后，發(fā)酵時間再延長，黑曲霉就會把先前降解成的肽類和氨基酸等繼續(xù)降解為氨等揮發(fā)掉，致使發(fā)酵產(chǎn)品中酸溶蛋白含量下降。

3.1.2 發(fā)酵溫度

發(fā)酵溫度對黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響見表2。

由表2可見，隨著發(fā)酵溫度的升高，產(chǎn)品中酸溶蛋白的含量先是逐漸上升，而后又逐漸降低，這是因為初始溫度低于黑曲霉產(chǎn)酶的最適溫度，從低溫到最適產(chǎn)酶溫度黑曲霉產(chǎn)酶量會逐漸增加，所以酸溶蛋白含量也隨溫度升高而上升。隨后溫度提高致黑曲霉生長速度加快，產(chǎn)生大量孢子，反而不利于產(chǎn)酶，所以達最適產(chǎn)酶溫度后，再提高溫度高反而致酸溶蛋白含量降低。

3.1.3 接種量

接種量對黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響見表3。

表2 發(fā)酵溫度對黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響%

表3 接種量對黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響%

由表3可見，發(fā)酵后酸溶蛋白質(zhì)含量隨接種量的提高而逐漸上升，達一定程度后又開始下降，原因可能是接種量達一定比例后，發(fā)酵底物豆粕中微生物會達到飽和，相互競爭底物，競爭的結(jié)果反而不利于部分發(fā)酵微生物的生存。

3.1.4 料水比

料水比對黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響見表4。

由表4可見，料水比約為1∶0.9，發(fā)酵產(chǎn)品中酸溶蛋白含量最高，這是因為發(fā)酵微生物生長需要一定含量的水分，料水比低，發(fā)酵料中水分就供應(yīng)不足，使微生物生長受到抑制，不利于產(chǎn)酶，從而導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)品中酸溶蛋白含量低。相反，料水比高，發(fā)酵料過濕，就會影響發(fā)酵原料的透氣性，同樣使黑曲霉生長受到抑制。

表4 料水比對黑曲霉發(fā)酵豆粕的影響%

3.2 正交試驗結(jié)果及分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以發(fā)酵時間、溫度、接種量和料水比，做L9（34）正交優(yōu)化試驗。正交試驗結(jié)果見表5～6。

表5 正交試驗L9（34）因素水平

由表6直觀分析表明，影響黑曲霉發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白含量的4個因素的主次順序依次是：時間＞溫度＞料水比＞接種量，理論上酸溶蛋白含量最高的組合是A2B2C1D2，即發(fā)酵時間72 h、溫度28℃、接種量4%和料水比1∶0.9。

表6 正交試驗L9（34）直觀分析

由表6正交試驗方差分析表明，發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度分別對黑曲霉發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白含量有極顯著影響和顯著影響。

因正交試驗中未包含最佳發(fā)酵組合A2B2C1D2，根據(jù)理論最佳發(fā)酵組合條件進行驗證試驗，發(fā)酵后測得發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白含量平均為13.62%，含量高于正交試驗中所有試驗組合。所以A2B2C1D2是本試驗的最佳發(fā)酵組合條件，即發(fā)酵時間72 h、溫度28℃、接種量4%和料水比1∶0.9。

4 討 論

應(yīng)用發(fā)酵技術(shù)處理豆粕，是有效提高豆粕品質(zhì)的方法之一，在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生可以直接被動物吸收的小肽和其他多種生物活性物質(zhì)，這對動物的生長十分有利[4]。小分子蛋白含量是衡量發(fā)酵豆粕質(zhì)量的主要指標(biāo)之一，我國企業(yè)常使用三氯乙酸酸溶蛋白作為發(fā)酵豆粕中小分子蛋白含量的常規(guī)檢測方法。

黑曲霉發(fā)酵豆粕能提高豆粕中酸溶蛋白的含量，主要是由于黑曲霉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸性蛋白酶、纖維素酶等消化酶對豆粕原料進行消化的結(jié)果，所以在試驗中影響消化酶產(chǎn)量和消化酶活力的因素均可能對發(fā)酵產(chǎn)品中酸溶蛋白含量產(chǎn)生影響。本試驗所用黑曲霉菌株是經(jīng)過N+注入誘變選育的高產(chǎn)酸性蛋白酶菌株，不僅具有很強的產(chǎn)酸性蛋白酶的能力，而且還具有很強的產(chǎn)纖維素酶和果膠酶的能力[5]。另外，黑曲霉產(chǎn)生的酸性蛋白酶主要是端肽酶（如天冬氨酸蛋白酶），端肽酶能從大豆蛋白肽鏈的末端開始水解，特異性地切斷疏水性多肽末端的兩種疏水性氨基酸，使大分子蛋白被切成數(shù)段的小分子，即大豆肽。Yoshitsugu等研究發(fā)現(xiàn)，酸性蛋白酶酶解的產(chǎn)物主要是相對分子質(zhì)量為300～600的小肽，酸性羧肽酶的酶解產(chǎn)物主要是相對分子質(zhì)量為200～400的小肽[6]。由于黑曲霉還能分泌的纖維素酶、果膠酶等消化酶，這些消化酶能破壞植物原料細胞壁，促使細胞中的營養(yǎng)物質(zhì)釋放出來，利于酸性蛋白酶與大分子蛋白充分接觸，大分子蛋白被降解為小分子蛋白。衛(wèi)琳等用黑曲霉AS3.350固態(tài)發(fā)酵豆粕生產(chǎn)大豆肽，研究得到最佳工藝條件為發(fā)酵料坯中豆粕含量為87%、pH 5.8、發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為90 h，在該條件下發(fā)酵豆粕中大豆肽的轉(zhuǎn)化率為62.35%[7]。秦衛(wèi)東等在用黑曲霉發(fā)酵豆粕制備抗氧化肽的試驗中發(fā)現(xiàn)，在接種量為2%、發(fā)酵液pH 6.0、底物質(zhì)量濃度9 g·100mL-1、發(fā)酵時間34 h的條件下，所得發(fā)酵液中豆粕多肽的質(zhì)量濃度最高，為3.38mg·mL-1[8]。由以上試驗可以看出，上述黑曲霉發(fā)酵豆粕試驗結(jié)果與本試驗結(jié)果具有一致性，即黑曲霉發(fā)酵豆粕能提高產(chǎn)品中小分子蛋白的含量。嚴(yán)鶴松通過對影響黑曲霉發(fā)酵豆粕進行正交實驗，結(jié)果表明，最佳的發(fā)酵工藝條件為接種量0.5%、料水比1∶1、發(fā)酵時間3 d、溫度35℃、裝料量20 g（直徑7 cm×高8 cm罐頭瓶中）[9]。

5 結(jié)論

本試驗表明，發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度是影響黑曲霉發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白含量的主要因素，經(jīng)過正交試驗優(yōu)化與分析得到最佳發(fā)酵工藝條件，即發(fā)酵時間72 h、溫度28℃、接種量4%和料水比1∶0.9。黑曲霉發(fā)酵豆粕能明顯提高豆粕中的酸溶蛋白含量，提高豆粕的營養(yǎng)水平，酸溶蛋白含量由發(fā)酵前的1.75%提高到13.62%。

[1]李建.發(fā)酵豆粕研究進展[J].糧食與飼料工業(yè),2009（6）:31-35.

[2]蔡輝益,霍啟光.飼用微生物飼料添加劑研究與應(yīng)用進展（續(xù)）[J].飼料工業(yè),1993,14（5）:7-11.

[3]王春芳,王彩玲,程茂基.黑曲霉固態(tài)生料發(fā)酵對棉粕中游離棉酚的影響[J].飼料博覽,2011（1）:25-26.

[4]王立波,李斌.發(fā)酵豆粕工藝與固體發(fā)酵過程監(jiān)測指標(biāo)初探[J].飼料博覽,2010（9）:25-27.

[5]程茂基,陳麗娟,蔡克周,等.N+注入選育黑曲霉益生菌及其突變菌株產(chǎn)酶條件的研究[J].微生物學(xué)報,2005,45（4）:534-538.

[6]Yoshitsugu I,Tasuku Y,Toshinari T,etal.Properties of the peptides liberated from rice protein in Sokujo-moto[J].Journal of Bioscienceand Bioengineering,1999,88（3）:276-280.

[7]衛(wèi)琳,宋俊梅,寧維穎.黑曲霉固態(tài)發(fā)酵制備大豆肽發(fā)酵條件的研究[J].飼料工業(yè),2008,29（18）:51-52.

[8]秦衛(wèi)東,陳學(xué)紅,馬利華.黑曲霉發(fā)酵豆粕制備抗氧化肽研究[J].食品科學(xué),2010,31（23）:289-293.

[9]嚴(yán)鶴松.黑曲霉發(fā)酵豆粕的研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.