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    天然冰片的研究進(jìn)展

    2011-05-04 13:25:32曾建國(guó)
    關(guān)鍵詞:龍腦右旋冰片

    曾建國(guó)

    天然冰片的研究進(jìn)展

    曾建國(guó)*

    本文主要通過(guò)對(duì)天然冰片的來(lái)源、研究應(yīng)用現(xiàn)狀以及資源改良等方面的研究進(jìn)展情況進(jìn)行綜述,為天然冰片資源的深入開發(fā)提供參考。

    天然冰片 右旋龍腦 靶向改良 龍腦樟

    天然冰片又名龍腦、龍腦香、梅花冰片、梅花腦等,為名貴中草藥材之一。具有開竅醒神、清熱止痛之功效[1],常用于赤翳膜、咽喉腫痛、驚風(fēng)痰迷及中風(fēng)口噤等病癥。歷代古籍中常有天然冰片的藥用記載,《唐本草》:“龍腦香及膏香出婆律國(guó),樹形似杉木,腦形似白松脂,明凈者善?!?;《本草綱目》:“龍腦者,以白瑩如冰及作梅花片者為良,故俗呼為冰片腦”。天然冰片大約有二千年以上的應(yīng)用歷史[2]。由于天然冰片為天然右旋龍腦,具有左旋龍腦、合成冰片所無(wú)可比擬的用藥安全優(yōu)勢(shì),甚至開發(fā)為防治病蟲害和抑菌的日化或農(nóng)藥產(chǎn)品而日益受到重視[3],應(yīng)用越來(lái)越廣泛。由于天然冰片的來(lái)源植物龍腦香樹(Dryobalanops aromatica Gaertn.f.)資源日益枯竭,天然冰片呈現(xiàn)出供不應(yīng)求的趨勢(shì)。通過(guò)科研工作者的不懈努力,發(fā)現(xiàn)香樟(Cinnamomum camphora (Linn.) Presl)、陰香(Cortex Cinnamomi Burmannii)、 油 樟(Cinnamomum longepaniculatum)等樟科植物中某些特定化學(xué)類型植物如龍腦樟(Cinnamomum camphora (L.) Presl)含有較高含量的天然冰片,這為天然冰片提供了豐富的植物來(lái)源。國(guó)內(nèi)對(duì)于龍腦樟資源進(jìn)行的深入研究主要集中在種質(zhì)資源保存、育苗、促生長(zhǎng)、生長(zhǎng)環(huán)境等方面。本文就天然冰片的來(lái)源、研究與應(yīng)用、植物資源改良等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,旨在為天然冰片資源的深入開發(fā)利用提供參考。

    一、天然冰片的來(lái)源與資源植物研究進(jìn)展

    冰片可分為冰片(Borneolum Syntheticum)、艾片(L-borneolum)和天然冰片(Borneolum),三者均已被《中國(guó)藥典》2010版收錄,其中冰片為合成龍腦,艾片為左旋龍腦,天然冰片為右旋龍腦。

    冰片(合成龍腦)又稱機(jī)制冰片,合成龍腦主要通過(guò)松節(jié)油中α-蒎烯經(jīng)酯化、水解得到[4],又稱合成冰片,為左旋龍腦和右旋龍腦的混合物。

    左旋龍腦的主要來(lái)源植物為艾納香。艾納香(Blumea blasamifera (L.) DC.)為菊科艾納香屬植物,別名大風(fēng)艾、家風(fēng)艾、大毛藥、冰片艾等,為多年生草本植物,主要分布在中國(guó)、印度、泰國(guó)、緬甸、巴基斯坦、印度尼西亞、菲律賓等國(guó)。我國(guó)艾納香主要分布在貴州、云南、廣西、廣東、福建、海南和臺(tái)灣,以貴州分布最為廣泛。艾納香全株含有揮發(fā)油,主要成分為左旋龍腦,并含有黃酮類及萜類等化學(xué)成分,艾納香的葉和嫩枝是提取天然左旋龍腦的重要原料,貴州為我國(guó)左旋龍腦的主要產(chǎn)區(qū)。

    艾納香始載于《開元本草》,其藥用部位為葉、枝、根,現(xiàn)代多以艾納香的嫩枝、葉作為原料提取左旋龍腦。艾納香嫩枝、葉以每年10月采收為宜,采收后洗凈切碎,經(jīng)蒸餾、冷凝可得到白色晶體,晶體經(jīng)過(guò)純化處理即得到高純度左旋龍腦。左旋龍腦具有開竅醒神,清熱止痛的作用,是多種成藥及民族藥(苗藥)的組成部分[5]。

    天然冰片為右旋龍腦,最早的植物來(lái)源為龍腦香科植物龍腦香樹,主產(chǎn)于印度尼西亞、菲律賓、印度、馬來(lái)西亞,我國(guó)歷來(lái)依靠進(jìn)口滿足需求。隨著科研工作的不斷深入,天然冰片資源植物日益受到重視。據(jù)統(tǒng)計(jì),世界范圍內(nèi)有100余種植物中含有龍腦,樟科樟屬植物廣泛含有龍腦[6]。樟屬(Cinnamomum)植物資源非常豐富,約250種,生長(zhǎng)于熱帶、亞熱帶,亞洲東部、澳大利亞及太平洋島嶼均有。我國(guó)約有46種和1變型。樟屬植物具有生物多樣性的獨(dú)特表現(xiàn)形式,根據(jù)其中精油組成成分以及含量等方面的差異,同一個(gè)種內(nèi)可分為幾個(gè)不同的化學(xué)型,這是樟屬植物各個(gè)種的共性和普遍現(xiàn)象。樟屬植物中含有右旋龍腦的有香樟、油樟、陰香等數(shù)種,其中香樟中龍腦型(龍腦樟)葉精油含右旋龍腦81.78%,油樟中龍腦型葉精油的右旋龍腦含量為77.57%,陰香中的梅片樹、油腦計(jì)樹分別含右旋龍腦70.81%、32.50%[7],香樟中龍腦樟的天然冰片含量高于其他兩個(gè)類型。龍腦樟是20世紀(jì)80年代在新晃縣首次發(fā)現(xiàn)并發(fā)展起來(lái)的樟樹化學(xué)類型。由于其枝葉精油中右旋龍腦含量高,資源豐富,已經(jīng)成為提取右旋龍腦的主要原料。2009年湖南省新晃縣龍腦開發(fā)有限責(zé)任公司培育的龍腦樟獲國(guó)家植物新品種保護(hù),依據(jù)《中華人民共和國(guó)植物新品種保護(hù)條例》,新晃龍腦公司對(duì)該植物擁有20年的獨(dú)占權(quán)。

    湖南省新晃縣龍腦開發(fā)有限責(zé)任公司利用龍腦樟無(wú)性系規(guī)?;旆庇缂夹g(shù)進(jìn)行規(guī)模化繁殖,建成龍腦樟規(guī)?;旆庇缡痉痘睾妄埬X樟工業(yè)化原料林,為天然冰片的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供了足夠的植物資源,已形成天然冰片的工業(yè)化生產(chǎn)基地。江西吉安林科所也在從事天然冰片的研究與開發(fā)[8]。

    二、天然冰片的研究與應(yīng)用

    目前天然冰片的主要來(lái)源植物為龍腦樟,龍腦樟的新鮮枝葉為提取天然冰片的主要原料。龍腦樟枝葉中含有大量的揮發(fā)油,揮發(fā)油組成成分比較復(fù)雜,其成分有:α-側(cè)柏烯(α-thujene), α-蒎 烯(α-pinene),莰 烯 (camphene),3-莰烯(3-camphene),β-蒎 烯(β-pinene),α-月 桂烯(α-nyrcene),α-水 芹 烯(α-phellenadrene),對(duì)聚傘花素(P-cymere),桉油精(cineole),檸檬 烯(limonene),羅 勒 烯(ocimene),松 油 烯(β-ocimene),芳樟醇(linalool),樟腦(camphor),天然冰片(d-borneol),β-松油醇(β-terpineol),α-松油醇(α-terpineol),乙酸橙花酯(neryl acette),α-異黃樟烯(α-isosafrole),乙酸龍腦酯(bornyl acetate),β-欖香烯 (β-elemene),順式丁香烯(ciscaryophyllene),丁香烯(α-caryophyllene),吉馬烯(germacerne-D)等[9],其中天然冰片為主要成分,百分含量為71%~80%。

    通過(guò)對(duì)湖南新晃地區(qū)龍腦樟的研究發(fā)現(xiàn),不同部位中總揮發(fā)油含量以及揮發(fā)油中右旋龍腦所占比例有明顯差異。其中果實(shí)的揮發(fā)油含量最高,以甲基丁香酚、樟腦及龍腦為主;根的木質(zhì)部中揮發(fā)油含量最低,以甲基丁香酚為主;龍腦樟葉的揮發(fā)油含量在1.6%左右,其中右旋龍腦為主要成分,質(zhì)量百分比可達(dá)80%。龍腦樟樹葉為龍腦樟生物資源總量最豐富且易于再生的部位。

    湖南省中藥提取工程研究中心、湖南省新晃縣龍腦開發(fā)有限責(zé)任公司等承擔(dān)的國(guó)家科技部“十一五”支撐計(jì)劃項(xiàng)目的課題研究表明,龍腦樟枝葉中右旋龍腦的含量與植株的生長(zhǎng)年限有關(guān),右旋龍腦的含量隨生長(zhǎng)年限增長(zhǎng)逐漸上升,并逐漸趨于穩(wěn)定。龍腦樟枝葉在不同生長(zhǎng)周期中右旋龍腦含量的變化無(wú)顯著性差異。天然冰片的傳統(tǒng)加工方法為水蒸汽蒸餾法,該過(guò)程右旋龍腦的提取率僅為50%左右,其余的右旋龍腦均在提取、加工或殘?jiān)鼩埩糁袚p失,大量浪費(fèi)龍腦樟植物資源。課題組擬通過(guò)改進(jìn)水蒸汽蒸餾法提取右旋龍腦工藝過(guò)程的參數(shù),優(yōu)化工藝,提高右旋龍腦提取率;同時(shí)還探討基于鮮葉勻漿后通過(guò)有機(jī)溶劑浸潤(rùn)的再提取分離工藝研究,在提高右旋龍腦提取率的同時(shí)最大程度降低生產(chǎn)成本。若通過(guò)開發(fā)出適合于生產(chǎn)天然冰片的高效提取設(shè)備,使生產(chǎn)工藝達(dá)到安全、簡(jiǎn)單、低成本生產(chǎn)的目標(biāo),右旋龍腦提取率可達(dá)80%以上,實(shí)現(xiàn)龍腦樟植物資源的高值化利用是完全可能的。

    藥理研究表明,天然冰片具有多種直接治療作用,包括對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用,抗病原微生物作用,抗炎鎮(zhèn)痛作用,抗生育作用。此外,冰片能夠促進(jìn)藥物吸收,提高血管壁的通透性,開放血-腦脊液屏障及血腦屏障,抑制共用藥物在生物體內(nèi)的代謝速度,提高其生物利用度。

    由于天然冰片、艾片及合成冰片化學(xué)構(gòu)象上存在差異,其用藥安全性方面也體現(xiàn)出一定的差別。研究表明,三者對(duì)小鼠的半數(shù)致死量(LD50以天然冰片劑量最大,合成冰片次之,艾片最小[10],高劑量合成冰片對(duì)小鼠的一般生殖毒性高于天然冰片。目前中藥復(fù)方中多使用合成龍腦,其質(zhì)量不穩(wěn)定,其中的龍腦成分在貯藏過(guò)程中容易轉(zhuǎn)化為有毒性的樟腦[11],影響了中藥復(fù)方的質(zhì)量而天然冰片藥用安全性最高。天然冰片除了應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域外,還廣泛應(yīng)用于煙草、日化、食品農(nóng)藥等領(lǐng)域。由于天然冰片、艾片、合成冰片在價(jià)格上差別懸殊,天然冰片在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用受到一定的限制。

    三、龍腦的生源合成與人工合成簡(jiǎn)介

    龍腦含有10個(gè)碳原子及兩個(gè)異戊二烯單元為單萜類化合物。其生源合成途徑已被證實(shí)為甲戊二酸途徑(MVA)(見圖1)[12]。在植物體內(nèi)羥甲戊二酰輔酶A在其還原酶的作用下被還原成甲羥戊酸(圖1中的1)。如圖1所示,甲羥戊酸通過(guò)磷酸化、脫羧生成焦磷酸酯5和6,再經(jīng)過(guò)聚合、異構(gòu)化得到焦磷酸酯8,隨后脫去焦磷酸根得到碳正離子9,中間體9發(fā)生重排生成龍腦。

    人工合成龍腦一般采用α-蒎烯為原料[13]經(jīng)適當(dāng)催化劑在酸性條件下催化生成碳正離子中間體,再與羧酸負(fù)離子結(jié)合生成酯,經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的皂化反應(yīng)水解得到右旋龍腦(圖2)。但如果催化劑選用不當(dāng),α-蒎烯在酸性條件下可能生成莰烯,隨后經(jīng)過(guò)重排、酯化、水解后得到左旋龍腦人工合成龍腦一般采用草酸和氯乙酸作為原料與α-蒎烯反應(yīng),其中應(yīng)用草酸法合成龍腦在國(guó)內(nèi)外已有50年歷史。

    圖2 采用α-蒎烯為原料合成龍腦

    四、龍腦樟資源改良研究狀況

    目前對(duì)龍腦香科種子種質(zhì)資源保存技術(shù)以及脫水過(guò)程中生理生化變化和貯藏條件對(duì)種子活力的影響等方面研究得較多。此外,對(duì)頑拗型的龍腦香科種子脫水的敏感性機(jī)制也有研究。研究種子的貯藏首先要確定種子的貯藏行為類型是正常型還是頑拗型。而龍腦香科樹的種子在貯藏行為上屬于頑拗型[14],其貯藏壽命與種子含水量的具體研究結(jié)果見表1。溫度對(duì)大多數(shù)龍腦香科種子的貯藏最顯著的影響是低溫?fù)p傷[15-18],所以多數(shù)龍腦香科植物種子不能在低溫下貯藏,具體研究結(jié)果見表2。在貯藏介質(zhì)的使用上,可有效延長(zhǎng)龍腦香科種子貯藏壽命的介質(zhì)有木炭、泥炭、鋸屑、沙和塑料袋等,而貯藏容器內(nèi)穩(wěn)定的濕度對(duì)避免種子失水有很好的效果。另外,良好的通氣在貯藏龍腦香科種子時(shí)可趕走有毒氣體,避免種子缺氧,增加氧氣含量,從而提高種子貯藏壽命。表3是一些介質(zhì)和通氣等條件對(duì)龍腦香科種子貯藏壽命的影響結(jié)果。如果能在今后的研究手段中運(yùn)用分子生物學(xué)研究方法,通過(guò)對(duì)植物基因的序列差異以及不同時(shí)間和空間上的基因表達(dá),進(jìn)一步研究龍腦香科植物屬不同物種之間的進(jìn)化歷史,并分析這些植物種子脫水耐性的差異,可了解龍腦香科種子脫水耐性的演化關(guān)系。

    表1 龍腦香科種子含水量和貯藏壽命關(guān)系表

    表2 貯藏溫度對(duì)龍腦香科種子貯藏壽命的影響

    表3 貯藏介質(zhì)、濕度以及通氣對(duì)龍腦香科種子貯藏壽命的影響

    在龍腦樟資源開發(fā)上,湖南省農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)辦與新晃天然冰片有限公司等[19]從1995年起對(duì)龍腦樟樹扦插育苗技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn),龍腦樟扦插育苗快繁技術(shù)與種子繁殖育苗和嫁接育苗相比具有成活率高、生長(zhǎng)整齊、經(jīng)濟(jì)適用、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),并能保持龍腦樟優(yōu)良母株的各種優(yōu)良性狀如速生、豐產(chǎn)、抗病、再生和個(gè)體的遺傳性狀得到穩(wěn)定延續(xù),解決了天然右旋龍腦資源短缺的難題,是實(shí)現(xiàn)龍腦樟種苗生產(chǎn)快速繁殖和大面積造林的關(guān)鍵技術(shù),適宜大面積推廣應(yīng)用。在栽培技術(shù)上,江西吉安市林業(yè)科學(xué)研究所[20,21,22]對(duì)不同立地條件、不同施肥量、不同采割時(shí)間和不同采割方式的龍腦樟矮林作業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益也進(jìn)行了對(duì)比研究(見表4,表5,表6)。

    表4 不同施肥試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

    表5 不同施肥試驗(yàn)效益分析

    湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心在前期實(shí)驗(yàn)中,以水稻(Oryza sativa)為內(nèi)標(biāo),用流式細(xì)胞儀對(duì)水稻和龍腦樟樣品進(jìn)行測(cè)定,通過(guò)比較水稻與龍腦樟樣品峰值的倍數(shù)關(guān)系,計(jì)算出龍腦樟的基因集大小,初步測(cè)得龍腦樟基因集約為478Mb(表7為水稻與龍腦樟基因及大小數(shù)據(jù)結(jié)果)。本研究是世界上首次測(cè)定龍腦樟基因集大小,其藥用植物代謝累積與綜合利用課題組的后續(xù)計(jì)劃將與深圳華大基因研究院合作,從基于調(diào)控右旋龍腦代謝積累的龍腦樟基因組學(xué)研究入手進(jìn)行其靶向改良的研究。

    表6 不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑生物量、精油含量、龍腦產(chǎn)量、凈增產(chǎn)值試驗(yàn)結(jié)果

    與歐美國(guó)家相比,我國(guó)在藥用植物資源的應(yīng)用開發(fā)上有著千百年的市場(chǎng)文化基礎(chǔ)這一優(yōu)勢(shì)。雖然對(duì)龍腦樟的研究主要集中在對(duì)其種子特性及植物栽培技術(shù)的研究上,并取得了一定的研究成果,但是在分子機(jī)制的研究上與發(fā)達(dá)國(guó)家相比還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。如何利用系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)研究將天然藥物(右旋龍腦)與資源植物龍腦樟相結(jié)合并實(shí)現(xiàn)其靶向改良(定向培育),是我們目前需要重點(diǎn)加強(qiáng)的。因此,充分利用我國(guó)龍腦資源植物的優(yōu)勢(shì),系統(tǒng)地通過(guò)各種組學(xué)的方法,特別是基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的方法,結(jié)合植物本身右旋龍腦的代謝累積規(guī)律來(lái)挖掘調(diào)控次生代謝產(chǎn)物右旋龍腦的關(guān)鍵調(diào)控因子,對(duì)于充分提高龍腦樟植物資源的利用率和對(duì)其進(jìn)行靶向改良、培育新品種有著十分重要的意義。

    天然冰片作為藥材較為特殊,它不是一般的植物藥材,實(shí)際上是純度已達(dá)99%的右旋龍腦雖然其本身已具備了一個(gè)天然藥物的屬性,但對(duì)其來(lái)源植物進(jìn)行任何基于提高資源植物右旋龍腦代謝積累量的改良,從理論上仍是被允許的,因?yàn)椴⒉皇怯脕?lái)源植物藥材直接入藥。右旋龍腦作為主要來(lái)源植物龍腦樟的次生代謝產(chǎn)物,其量的積累水平和可利用植物部位的生物總量就應(yīng)該作為評(píng)價(jià)該來(lái)源植物質(zhì)量?jī)?yōu)劣的最基本要素。其量的積累水平主要基于遺傳、環(huán)境和栽培管理等三大人為因素。過(guò)去我們對(duì)次生代謝產(chǎn)物積累水平的普遍關(guān)注度放在環(huán)境(所謂道地性)和栽培、采收、加工技術(shù)等人為因素上。隨著基因組學(xué)的發(fā)展,尤其是后基因組學(xué)時(shí)代的到來(lái),人們?cè)诔浞株P(guān)注環(huán)境等誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物積累水平的基礎(chǔ)上,開始注重其基因源頭調(diào)控機(jī)理的研究。若通過(guò)基因組--表觀組--轉(zhuǎn)錄組--蛋白質(zhì)組--代謝組--表型組的大貫穿研究,發(fā)現(xiàn)調(diào)控右旋龍腦的遺傳因素,并通過(guò)分子育種、定向培育實(shí)現(xiàn)基于右旋龍腦的靶向改良,使右旋龍腦在龍腦樟樹葉中的代謝累積達(dá)到5%左右應(yīng)該是可能的。倘若如此,我們?cè)谔崛」に嚿媳WC80%的提取率,使天然冰片產(chǎn)品收得率達(dá)到4%,那么天然冰片的成本就可能與機(jī)制冰片接近,其市場(chǎng)應(yīng)用將十分廣泛。目前天然冰片在醫(yī)藥、香料、食品等領(lǐng)域用途廣泛,適宜的價(jià)格培育出來(lái)的市場(chǎng)需求量將遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)現(xiàn)在的供給量,預(yù)計(jì)達(dá)到1000噸也完全有可能。在天然冰片來(lái)源植物資源改良、生產(chǎn)工藝、藥理藥效、安全性及大健康領(lǐng)域中的應(yīng)用開發(fā)等方面進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究將成為天然冰片推廣應(yīng)用的研究熱點(diǎn)。讓天然冰片這一優(yōu)勢(shì)天然資源為人類健康乃至動(dòng)植物健康發(fā)揮其獨(dú)特的作用,具有巨大的發(fā)展?jié)摿?,將?chuàng)造十分可觀的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。

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    *曾建國(guó),博士,湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)教授,國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心副主任,湖南長(zhǎng)沙 410128

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