胃癌組織中Sonic Hedgehog表達(dá)及其與NF-kappaB的關(guān)系研究

嚴(yán) 華 劉海林 王?？?/p>

胃癌是1種具有較高發(fā)病率的惡性腫瘤，其形成和慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生等癌前病變密切相關(guān)。大量的流行病學(xué)調(diào)查證明，幽門螺旋桿菌感染可以導(dǎo)致胃黏膜細(xì)胞癌基因表達(dá)異常，同時(shí)引起炎癥反應(yīng)，長期慢性炎癥可以刺激細(xì)胞增殖，而細(xì)胞增殖不僅增加了DNA自發(fā)復(fù)制錯(cuò)誤的機(jī)會，同時(shí)也增加了DNA受外來突變因子損傷的可能性［1］。

Sonic Hedgehog(SHH)信號通路是自我更新信號通路之一，在人類胚胎發(fā)育過程中調(diào)控細(xì)胞增殖分化，胚胎發(fā)育成熟后進(jìn)入失活狀態(tài)［2］。該通路的異常激活已被證實(shí)與胰腺癌、皮膚基底細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、前列腺癌等有關(guān)［3］。SHH信號通路可能與胃癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)［4］。正常胃組織中SHH基因表達(dá)極少;而胃癌組織中SHH的表達(dá)顯著增強(qiáng)，這一過程與SHH基因的啟動子去甲基化有關(guān)［5］。SHH表達(dá)能促進(jìn)潰瘍邊緣新生胃腺細(xì)胞的再生，在胃潰瘍修復(fù)過程中參與了胃腺細(xì)胞的分化［6］。

作為一個(gè)與胃癌發(fā)生，發(fā)展密切相關(guān)的信號分子，SHH和幽門螺旋桿菌有著復(fù)雜的相互關(guān)系。在幽門螺旋桿菌誘導(dǎo)的萎縮性胃炎組織中，SHH表達(dá)顯著降低［7］。而根除幽門螺旋桿菌能使腸上皮化生患者和動物模型的胃黏膜恢復(fù) SHH表達(dá)［8，9］。

胃癌的發(fā)生是由胃黏膜干細(xì)胞突變后異常增殖、并經(jīng)歷不同的癌前病變發(fā)展為胃癌干細(xì)胞［10］，而Hedgehog信號通路是調(diào)節(jié)胃黏膜干細(xì)胞和胃癌干細(xì)胞均必不可少的［11］。我們選擇了50例萎縮性胃炎、46例腸化生和57例胃癌患者的內(nèi)鏡下取材的黏膜組織，同時(shí)選擇30例正常人作為對照。研究了Hedgehog在胃癌不同階段中的表達(dá)及與炎癥反應(yīng)、幽門螺旋桿菌感染的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本組研究患者，選擇2008年11月至2010年5月我院消化科胃鏡檢查患者和上海上鋼社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心胃鏡檢查患者。年齡37～71歲，平均年齡(56.43±10.36)歲，包括50例萎縮性胃炎，46例腸化生和57例胃癌患者，同時(shí)選擇30例正常人作為對照;分為萎縮性胃炎組、腸化生組、胃癌組和正常組。NF-kappaB抑制劑PDTC購自Sigma公司。

1.2 Hpylori組織病理學(xué)檢測

在內(nèi)鏡下取病變處黏膜3～5塊，Giemsa染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，Hp緊貼胃黏膜面或位于胃小凹及淺層腺腔為Hp感染陽性。

1.3 SP免疫組化檢測胃黏膜中Hedgehog和NF-kappaB表達(dá)

石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水，雙蒸水沖洗3 min，暴露抗原(Hedgehog)染色組采用微波爐熱抗原修復(fù)法，滴加3%H2O210 min，用 PBS沖洗3次，每次5 min，加正常血清15 min，分別滴加一抗Hedgehog和NF-kappaB(1∶100)，37℃孵育1 h后4℃過夜。用PBS沖洗3×3'，再滴加生物素標(biāo)記的第二抗體，37℃孵育20 min，用PBS洗3 ×3'，最后每張切片加鏈霉素過氧化物酶溶液，37℃孵育20 min，PBS洗3 ×3'，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，0.1%鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。每張切片任意取10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出陽性細(xì)胞率。

1.4 細(xì)胞周期檢測

細(xì)胞周期用碘化丙啶(propidium iodide，PI)分析DNA含量，通過計(jì)算PI結(jié)合DNA后發(fā)出的熒光強(qiáng)度來檢測細(xì)胞倍體數(shù)，G0/G1期細(xì)胞DNA含量為2 n，G2期細(xì)胞為4 n，而S期細(xì)胞介于2 n和4 n之間。細(xì)胞以無血清1 640液或含10%血清1 640培養(yǎng)48 h，收集(1～2)×106細(xì)胞，離心 2 000 rpm，5 min。PBS(phosphate-buffered saline)洗1次后，一邊震蕩沉淀細(xì)胞，一邊加入75%乙醇，4℃固定至少24 h。測定細(xì)胞周期前，加入3倍固定液體積的PBS，混勻，離心2 000 rpm、5min。PBS再洗滌 1 次，離心 2 000 rpm、5 min。加10 μl RNaseA(終濃度 0.5 mg/ml)，37℃ 孵育 30 min。加PI(終濃度50μg/ml)染色，室溫置暗處15 min，流式細(xì)胞儀檢測(LSRII，Becton Dickinson)。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測

獲取的新鮮胃黏膜細(xì)胞用膠原酶和胰蛋白酶消化后，分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，離心2 000 rpm、5 min。PBS洗滌1次。用100μl 1×binding buffer重懸細(xì)胞，加2.5μl annexin V 和5 μl PI(終濃度為10 μg/ml)，暗處放置15 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 幽門螺旋桿菌感染率隨胃癌發(fā)展而升高

比較各組胃黏膜樣本中Hpylori感染情況，發(fā)現(xiàn)正常人群中其感染率很低，為16.7%(5/30)，萎縮性胃炎和腸化生組其感染率分別為38.0%(19/50)和58.7%(27/46)，與正常組比較明顯升高(P ＜0.05)。胃癌患者中 H pylori感染率為75.4%(43/57)，不僅顯著高于正常組，也高于萎縮性胃炎組和腸化生組(表1)，這表明H pylori感染與胃癌的發(fā)生具有高度相關(guān)性，隨著疾病發(fā)展，其感染率逐漸升高。

2.2 Hedgehog和NF-kappaB在各組織中的表達(dá)情況

應(yīng)用SP免疫組化法，檢測Hedgehog和NF-kappaB在各組胃黏膜組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Hedgehog陽性表達(dá)率萎縮性胃炎組和腸化生組顯著低于正常組和胃癌組，與Western blot結(jié)果相似。NF-kappaB陽性表達(dá)率正常組、萎縮性胃炎組與腸化生組比較，無顯著差異，而胃癌組其陽性率顯著增高(表2)。

表1 各組中幽門螺旋桿菌感染率情況(例)

表2 各組中SHH和NF－κB陽性表達(dá)情況±s，%)

表2 各組中SHH和NF－κB陽性表達(dá)情況±s，%)

注:﹡為與正常組比較，差異有顯著性意義，P＜0.01

陽性表達(dá)正常組組別 SHH陽性表達(dá) NF－κB 36.4 ±3.9 26.0 ±4.8萎縮性胃炎組 19.8±7.3﹡ 31.0±5.4腸化生組 25.7±8.7﹡ 34.0±5.8胃癌組 58.5±12.6﹡ 63.0±11.4﹡

2.3 細(xì)胞周期

在各組樣本中隨機(jī)選擇5例，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)代表靜止細(xì)胞的G0/G1期比例正常胃黏膜組較高，而萎縮性胃炎組、腸化生組和胃癌組則較低 (圖1)。

圖1 各組胃黏膜細(xì)胞的細(xì)胞周期分布

2.4 細(xì)胞凋亡

在各組樣本中隨機(jī)選擇5例，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)萎縮性胃炎組和腸化生組中胃黏膜細(xì)胞凋亡率較高(圖2)，分別為(33.6±2.9)%和 (34.7 ±3.4)%，顯著高于正常組(14.7 ±2.3)%和胃癌組(8.6 ±1.3)%。

2.5 胃癌細(xì)胞中SHH表達(dá)與NF－kappaB的關(guān)系

體外培養(yǎng)的原代胃癌細(xì)胞，經(jīng)NF-kappaB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)預(yù)處理24 h后，Western Blot檢測Sonic Hedgehog蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，隨PDTC濃度升高，Sonic Hedgehog蛋白表達(dá)水平降低，提示Sonic Hedgehog蛋白表達(dá)可能是NF-kappaB依賴性的，見圖3。

圖2 各組樣本胃黏膜細(xì)胞凋亡率情況

圖3 NF-kappaB抑制劑對Sonic Hedgehog蛋白表達(dá)的影響A為PDTC 0μM;B為PDTC 1μM;C為PDTC 5μM;D為PDTC 10μM

3 討論

Sonic Hedgehog是機(jī)體調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞、維持其自我更新的信號通路之一，在細(xì)胞正常分化成熟后進(jìn)入失活狀態(tài)。Hedgehog信號的異常激活導(dǎo)致胃黏膜細(xì)胞過度增殖而癌變。胃癌的發(fā)生是由胃黏膜干細(xì)胞突變后異常增殖、并經(jīng)歷不同的癌前病變發(fā)展為胃癌干細(xì)胞［10］，而Hedgehog信號通路是調(diào)節(jié)胃黏膜干細(xì)胞和胃癌干細(xì)胞均必不可少的［11］。

為了探討Hedgehog蛋白在胃癌的多步驟發(fā)病過程中所起的作用，我們應(yīng)用免疫組化技術(shù)，研究了Hedgehog在胃癌不同發(fā)展階段的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Hedgehog蛋白在癌前病變(萎縮性胃炎和腸化生)中表達(dá)最低，正常胃黏膜中等程度表達(dá)，而在胃癌中表達(dá)最高。我們的結(jié)果證實(shí)了其它學(xué)者的研究結(jié)果:在萎縮性胃炎和腸上皮化生組織中，Hedgehog表達(dá)是顯著降低的［7，12］。

那么Hedgehog在胃癌中的高表達(dá)是如何驅(qū)動的呢?我們的研究顯示隨著癌前病變向胃癌發(fā)展，幽門螺旋桿菌的感染率逐漸升高。幽門螺旋桿菌感染能在胃上皮細(xì)胞中重新激活Hedgehog表達(dá)，可能是胃癌中Hedgehog高表達(dá)的1個(gè)重要原因。

炎癥反應(yīng)是幽門螺旋桿菌導(dǎo)致胃癌的1個(gè)重要途徑。作為炎癥反應(yīng)的1個(gè)標(biāo)志蛋白，NF-kappaB具有抗凋亡和促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用。我們研究發(fā)現(xiàn)，NF-kappaB在胃癌中的陽性表達(dá)率顯著高于其它3組，而這3組之間則無顯著差異。其他學(xué)者也發(fā)現(xiàn)，NF-kappaB在III型腸化生中呈高表達(dá)，提示NF-kappaB激活可能是癌前病變進(jìn)入胃癌過程中的重要分子生物學(xué)事件［13］。

Sonic Hedgehog和NF-kappaB均在胃癌中呈高表達(dá)，它們之間是否存在相互關(guān)系?最近有研究發(fā)現(xiàn):Sonic Hedgehog是NF-kappaB的1個(gè)新靶點(diǎn)，參與了后者的凋亡抵抗和促增殖作用［14］。因此，胃癌中Sonic Hedgehog高表達(dá)很可能是NF-kappaB高表達(dá)直接調(diào)控的一個(gè)結(jié)果。我們還發(fā)現(xiàn):各組胃黏膜細(xì)胞凋亡率的變化趨勢和Sonic Hedgehog正好相反，即先升高后降低，進(jìn)一步證實(shí)了Sonic Hedgehog的抗凋亡作用。

我們還發(fā)現(xiàn)，與正常胃黏膜相比，萎縮性胃炎、腸上皮化生和胃癌的細(xì)胞周期的S期比例顯著升高，但后三者之間差別不顯著。S期比例升高意味著細(xì)胞增殖加快，細(xì)胞易于積累基因損傷和加速癌變。同時(shí)，我們注意到萎縮性胃炎和腸上皮化生細(xì)胞同時(shí)具有高增殖和高凋亡的特征，可能在這類癌前病變組織中存在著較強(qiáng)的選擇壓力，只有那些抵抗凋亡的細(xì)胞才能存活下來。這些細(xì)胞很可能就是具有高致瘤性的胃癌干細(xì)胞，它們高表達(dá)NF-kappaB和Hedgehog，通過選擇壓力存活下來，從而導(dǎo)致Hedgehog蛋白有癌前病變中的低表達(dá)變?yōu)槲赴┲械母弑磉_(dá)。

總之，我們研究提出了幽門螺旋桿菌感染導(dǎo)致胃癌發(fā)生的可能機(jī)制:幽門螺旋桿菌—炎癥反應(yīng)—NF-kappaB激活—Sonic Hedgehog表達(dá)上調(diào)—胃黏膜干細(xì)胞轉(zhuǎn)化—胃癌。與正常胃黏膜相比，胃癌癌前病變中Hedgehog呈低表達(dá)，但胃癌組織中顯著升高。本研究結(jié)果認(rèn)為，通過NF-kappaB促使正常干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變，使高表達(dá)Hedgehog的胃癌干細(xì)胞獲得存活優(yōu)勢，可能是Hedgehog在胃癌中呈高表達(dá)的重要原因。

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