L-精氨酸對大腸腫瘤細(xì)胞中 Ki67、iNOS的表達(dá)及血清 NO濃度的影響

中鐵一局集團(tuán)咸陽中心醫(yī)院外一科(咸陽 712000) 惠均武 高小鵬 馬清涌 王云檢

大腸癌患者常存在不同程度的代謝紊亂、營養(yǎng)不良和免疫功能低下。普通腸外營養(yǎng)雖能改善患者的營養(yǎng)狀況,但亦能刺激腫瘤細(xì)胞的分裂、增殖。20世紀(jì) 90年代以來,一系列的相關(guān)研究表明,某些營養(yǎng)物質(zhì)不僅能防治營養(yǎng)缺乏,而且能以特定方式刺激免疫細(xì)胞增強免疫應(yīng)答,抑制腫瘤細(xì)胞生長。目前研究較多并已開始應(yīng)用于臨床的營養(yǎng)素包括精氨酸等。早在 1974年Morson就提出了腺瘤→癌順序,積極診治大腸腺瘤是控制和減少大腸癌發(fā)病的重要途徑。目前除了手術(shù)切除腺瘤以外尚無良好的藥物預(yù)防大腸腺瘤到癌的轉(zhuǎn)變。

資料與方法

1 實驗對象 選擇 2003年 8月至 2004年 2月在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院住院治療的大腸癌和腺瘤患者各 60例,均經(jīng)病理學(xué)確診,隨機分為兩組:實驗組、對照組各 30例。兩組患者年齡、性別、發(fā)病部位、病理類型均無顯著性差異?；颊呔诟深A(yù)前半年內(nèi)未使用免疫抑制劑和增強劑;干預(yù)前未使用化療、放療;術(shù)中未切脾;無內(nèi)分泌、代謝性疾病。

2 給藥方法 實驗組患者每日口服 L-精氨酸30g(120ml),對照組患者每日口服 5%葡萄糖液120ml,連續(xù) 3d。

3 標(biāo)本采集 病理標(biāo)本:用藥前、后一日內(nèi)分別取癌旁組織(距腫瘤旁 5cm以內(nèi)),腫瘤組織,制成石蠟標(biāo)本。血液標(biāo)本:用藥前、后一日內(nèi)抽取外周靜脈血,肝素抗凝立即送檢。

4 SP免疫組化法檢測 Ki67和 iNOS的活性

標(biāo)本用福爾馬林固定,石蠟包埋,4 μ m連續(xù)切片。按試劑盒使用說明書進(jìn)行免疫組化 SP法操作。陽性的判定:Ki67以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性,iNOS以細(xì)胞質(zhì)、膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。標(biāo)記指數(shù)計算方法:雙人盲法觀片,隨機選取 10個高倍鏡視野共計數(shù) 1 000個細(xì)胞,以陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù),計算標(biāo)記指數(shù)。標(biāo)記指數(shù)(Labeling Index)=染色陽性細(xì)胞數(shù) /1000×100%。

5 Griess法測定大腸腫瘤患者血清 NO濃度取血漿 0.5ml加 75mmol? L-1硫酸 20ml搖勻 3 000r? min-1×10min離心,取上清 2ml加 1ml酸化的 10g? L-1對氨苯磺酸和 1ml酸化的 10g? L-1萘乙胺,37℃下反應(yīng) 10min,紫外 751分光光度儀 545nm處測定NO含量。

6 統(tǒng)計學(xué)分析 Ki67、iNOS標(biāo)記指數(shù)、血清 NO濃度用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用 SPSS10.0軟件進(jìn)行 t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 L-精氨酸對大腸腺瘤組織 Ki67、iNOS表達(dá)的影響 見表 1。干預(yù)前兩組大腸腺瘤組織 Ki67、iNOS標(biāo)記指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;干預(yù)后,實驗組Ki67標(biāo)記指數(shù)明顯降低、iNOS標(biāo)記指數(shù)明顯升高,組內(nèi)比較、與同期對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),對照組干預(yù)前后無明顯變化。

表1 大腸腺瘤實驗組與對照組 Ki67、iNOS表達(dá)檢測結(jié)果

2 L-精氨酸對大腸癌組織 Ki67、iNOS表達(dá)的影響 見表 2。干預(yù)前兩組大腸癌組織 Ki67、iNOS標(biāo)記指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;干預(yù)后,實驗組 Ki67標(biāo)記指數(shù)明顯降低、iNOS標(biāo)記指數(shù)明顯升高,組內(nèi)比較、與同期對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),對照組干預(yù)前后無明顯變化。

表2 大腸癌實驗組與對照組 iNOS、Ki67表達(dá)檢測結(jié)果

3 L-精氨酸對大腸腫瘤患者血清 NO濃度的影響 見表 3。干預(yù)前兩組大腸癌患者血清 NO濃度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;干預(yù)后,實驗組血清 NO濃度明顯升高,組內(nèi)比較、與同期對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),對照組干預(yù)前后無明顯變化。干預(yù)前、后大腸腺瘤患者血清 NO濃度無明顯變化。

表3 實驗組與對照組血清 NO濃度檢測結(jié)果 (μ mol/L)

討 論

Ki67是應(yīng)用廣泛的細(xì)胞增殖標(biāo)記。Ki67抗原的量隨細(xì)胞周期的不同而發(fā)生改變,在 G1中期到后期出現(xiàn)表達(dá),S期和 G2期逐漸增加,有絲分裂期達(dá)到高峰,分裂后迅速降解或丟失抗原決定簇?，F(xiàn)認(rèn)為 Ki67的功能與染色質(zhì)相連,與細(xì)胞的有絲分裂有關(guān)。 Ki67在大腸腫瘤研究中得到了廣泛應(yīng)用,大腸增生性息肉、腺瘤、腺瘤并部分組織癌變、腺癌的一份研究表明,隨腺瘤不同程度的異常發(fā)育 Ki67標(biāo)記指數(shù)逐漸增高,直至腺癌最高,可達(dá) 50%,各組別間存在顯著性差異[1]。Van Triest等[2]認(rèn)為 Ki67與病人的年齡、性別、Dukes分期、血管浸潤、分化程度等特征均有很好的相關(guān)性。有研究表明,L-精氨酸可抑制腫瘤的生長。馬清涌等[3]在研究 L-精氨酸對 Wistar大鼠實驗性結(jié)腸癌的作用及其機制中發(fā)現(xiàn) L-精氨酸可明顯降低結(jié)腸癌的體積,減少侵犯到粘膜下層的腺癌數(shù)量。莊巖等[4]研究 L-精氨酸對小鼠 S180移植瘤生長的影響時發(fā)現(xiàn)補充 L-精氨酸組可產(chǎn)生較谷氨酰胺組與 L-Arg-NAME組顯著較小的瘤重。本實驗發(fā)現(xiàn),補充 L-Arg后大腸癌組織、癌旁組織及腺瘤組織中 Ki67表達(dá)明顯減小(P＜0.05),提示 L-精氨酸具有抑制大腸腫瘤 Ki67表達(dá)的作用,從而抑制大腸腫瘤生長的作用。

近年來,有人提出 NO具有抗腫瘤作用。為了研究NO對腫瘤的影響,Jenkins等[5]采用基因工程技術(shù),把iNOS基因轉(zhuǎn)染入人結(jié)腸癌細(xì)胞株,成為 iNOS-19細(xì)胞克隆,使其能持續(xù)分泌 NO,并與不產(chǎn)生 NO的親代野生型瘤株進(jìn)行體外和體內(nèi)生長特性比較。在體外培養(yǎng)中,iNOS-19細(xì)胞克隆增殖速率較野生型親代對照組和轉(zhuǎn)染對照組慢。這種作用可使被 NOS抑制劑 LNIO逆轉(zhuǎn),說明在體外培養(yǎng)中 NO能抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Xie等[6]研究發(fā)現(xiàn),給高度轉(zhuǎn)移的小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染 iNOS基因,使其表達(dá) iNOS活性。當(dāng)產(chǎn)生高水平 NO時,則使腫瘤失去轉(zhuǎn)移性。 Jansson等在研究卡介苗(BCG)治療膀胱癌的實驗中,證實 BCG是通過增加膀胱上皮細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)量,誘導(dǎo) iNOS活性增加,進(jìn)一步使 NO產(chǎn)生增加而發(fā)揮作用的。本實驗發(fā)現(xiàn),補充 L-Arg后大腸癌組織、腺瘤組織 iNOS表達(dá)明顯升高(P＜0.05),提示 L-精氨酸具有促進(jìn)大腸腫瘤iNOS表達(dá)的作用。本實驗也發(fā)現(xiàn)補充 L-Arg后大腸癌患者血清中的 NO的濃度明顯升高(P＜0.05)。NO是由 NOS催化 L-Arg生成的。NO含量的動態(tài)變化是由 NOS的活性決定的,即 NOS活性越強,NO濃度越高。L-Arg可能通過促進(jìn)大腸腫瘤 iNOS表達(dá)來升高血清 NO的濃度。腺瘤患者血清 NO含量干預(yù)前后沒有明顯變化,但腺瘤組織 iNOS表達(dá)活性升高,有可能使腫瘤組織局部產(chǎn)生高濃度的 NO。由此看來,L-精氨酸—一氧化氮途徑是 L-精氨酸抑制腫瘤生長的一種作用機制,L-精氨酸對 iNOS表達(dá)的調(diào)節(jié)機制有待于進(jìn)一步研究。

[1] Kikuchi Y,Dinjens WW,Bosman FT.Proliferation and apoptosis in proliferative lesions of the colon and rectum[J].Virchous Arch,1997,431(2):111.

[2] Van Triest B,PinedoHM,Blaauwgeers JL,et al.Prognostic role ofthymidylatesynthase, thymidine phosphorylase platelet-derived endothelialcellgrow factor and proliferation markers in colorectal cancer[J].Clin Cancer Res,2000,6(3):1063.

[3] 馬清涌,王亞峰,徐 軍,等.L-精氨酸對實驗性結(jié)腸癌的作用與機理 [J].西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2001,22(6):532-534.

[4] 莊 巖,趙建勛,王文治,等.外源精氨酸攝入對移植瘤生長的抑制作用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2001,11(12):1-4.

[5] Jenkins DC,Charbs IG,Thomsen LL,et al.Roles of nitric oxide in tumor growth[J].Proc Natl Aced Sci USA,1999,92:4392-4396.

[6] Xie K,Huang S,Dong I,et al.Transfection with the inducible nitric oxide synthase gene suppresses tumorigenicityand abrogates metastasesby K-1735 murine melanoma cells[J].J Exp Med,1998,81:1333-1343.