帕金森病大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層神經(jīng)元電活動(dòng)及 5-HT1A受體表達(dá)的變化*

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腦病科(西安 710004)

尤雪梅▲ 張巧俊△ 李立博 王 濤★ 惠艷娉 馮建軍

帕金森病(Parkinson disease,PD)不僅僅是一個(gè)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的疾病,常同時(shí)并有抑郁、焦慮和認(rèn)知功能障礙等非運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的癥狀[1]。內(nèi)側(cè)前額葉皮層(Medial prefrontal cortex,mPFC)接受來自腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺(Dopamine,DA)能神經(jīng)纖維支配,m PFC與情感行為、學(xué)習(xí)與記憶等諸多腦的高級功能密切相關(guān)。因此,mPFC的神經(jīng)活動(dòng)以及受體功能的改變可能與 PD非運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)癥狀的出現(xiàn)和維持有關(guān)。然而,目前對于 PD狀態(tài)下 mPFC中神經(jīng)元的活動(dòng)以及各種受體變化的了解并不多。有研究證實(shí) mPFC中有高密度的 5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)受體表達(dá),其中 50%～60%的錐體神經(jīng)元和 20%～ 30%的 GABA能神經(jīng)元上都有 5-HT1A受體表達(dá),5-HT1A受體在神經(jīng)元的電活動(dòng)及遞質(zhì)釋放的調(diào)解中起重要作用[2～4]。為此,本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化方法觀察 5-HT1A受體在 PD模型大鼠 mPFC中的表達(dá)變化,以了解黑質(zhì)-紋狀體通路損毀對 m PFC中 5-HT1A受體表達(dá)的影響;采用玻璃微電極細(xì)胞外記錄法,觀察 PD模型大鼠 mPFC神經(jīng)元電活動(dòng)的變化。為進(jìn)一步闡明 PD狀態(tài)下 5-HT系統(tǒng)在帕金森病非運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)癥狀發(fā)生中的病理生理學(xué)機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康雄性 SD大鼠(260～320g)24只,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng),室溫 20～25℃,24h循環(huán)光照,自由攝食飲水,預(yù)養(yǎng) 1周后,隨機(jī)分為 2組,對照組 (n=8)和 PD組 (n=16)。

2 PD模型的制備 采用改進(jìn)的微量注射器與空心玻璃微電極結(jié)合的 6-羥多巴胺(6-hydrodopamine,6-OHDA)兩點(diǎn)腦內(nèi)微量注射法選擇性損毀右側(cè)黑質(zhì)致密部(SNc)的 DA能神經(jīng)元。根據(jù) Paxions-Watson大鼠腦定位圖譜定位 SNc,坐標(biāo):前囟后 AP-4.8～ 5.3mm,矢狀縫右旁開 1.8～ 2.3mm,顱骨膜下 D7.1～7.3mm。術(shù)后 1周行阿樸嗎啡(Apornorphine,APO)皮下注射檢測旋轉(zhuǎn)行為,若大鼠在注射后即出現(xiàn)向損傷對側(cè)(左側(cè))旋轉(zhuǎn),計(jì)數(shù) 10min,以 5min內(nèi)累計(jì)≥20轉(zhuǎn),視為成功的偏側(cè) PD大鼠模型。對照組為假手術(shù)組,手術(shù)方法與模型組大鼠相同,注射等量的生理鹽水。

3 電生理記錄和放電形式分析 電生理記錄在SNc損毀后第 3周進(jìn)行,記錄同側(cè) m PFC錐體神經(jīng)元的電活動(dòng)。大鼠用 20%的烏拉坦(1.2g/kg,i.p.)麻醉后將頭固定于腦立體定位儀上,右側(cè) mPFC的位置:前囟 +2.7～3.4 mm,矢狀縫右旁開 0.5～0.7 mm,顱骨膜下 1.5～ 4.0 mm。采用玻璃微電極細(xì)胞外記錄方法在體記錄大鼠 m PFC的神經(jīng)元放電。電極尖端直徑1～ 2 μ m,阻抗 10～ 30M Ω,充灌液為 0.5M/L醋酸鈉含 2%滂胺天藍(lán)。細(xì)胞放電經(jīng) MEZ-8201微電極放大器,顯示于 VC-10記憶示波器,以觀察電位波形和細(xì)胞放電形式,同時(shí)信號輸入監(jiān)聽器監(jiān)聽。將信噪比大于3∶1的、穩(wěn)定的單細(xì)胞放電經(jīng)生物電信號采集與分析系統(tǒng)進(jìn)入計(jì)算機(jī)后,作實(shí)時(shí)觀察、儲存和進(jìn)行頻率及放電形式的分析,采樣時(shí)間 5～ 10min。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中監(jiān)測大鼠心電,肛溫維持在(37±0.5)℃。根據(jù)放電間隔直方圖(ISIH),并結(jié)合原始放電序列,將神經(jīng)元的放電形式分為以下 3種類型:①規(guī)則放電:ISIH呈對稱分布;②不規(guī)則放電:ISIH呈隨機(jī)不對稱分部;③爆發(fā)式放電:ISIH呈逐漸衰減的正偏態(tài)分布。每一個(gè) ISIH的生成最少包含 500個(gè)連續(xù)的動(dòng)作電位,bin寬 4ms。另外,根據(jù) ISIH計(jì)算出平均放電間隔的變異系數(shù)。變異系數(shù)是放電間隔的標(biāo)準(zhǔn)差與平均放電間隔之比,反映神經(jīng)元電活動(dòng)的規(guī)則程度。

4 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn) ①標(biāo)本采集:20%烏拉坦(1.2g/kg體重)過量腹腔麻醉。自胸骨處 V形剪開胸腔暴露心臟,輕牽心臟自左心室插入粗針頭,迅速剪開右心耳,先以 37℃ 0.2%肝素生理鹽水 100ml快速灌注,繼以 4℃含 4%多聚甲醛的 0.1mol/L PBS液(pH7.4)先快后慢灌注固定。自枕骨大孔處開顱取出完整的腦組織。隨后置于 4%多聚甲醛溶液于 4℃冰箱中固定 3～ 4h后放入 20%蔗糖溶液過夜至沉底。用冰凍切片機(jī)切制連續(xù)冠狀切片,片厚 30 μ m,置于 0.01 mol/L PBS中。②免疫組織化學(xué)染色:切片在 0.01 mol/L PBS(pH7.4)中漂洗后入 0.3%Triton X-100的 0.01 mol/L PBS中浸泡 30 min(室溫 ),而后按ABC法,進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色:切片分別入兔抗 5-HT1A單抗(濃度 1∶1500以抗體稀釋液即 5%正常羊血清+ 0.3%Triton-100 in PBS稀釋)4℃下孵育48h;然后再入生物素標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(1∶500,Sigma),4℃ 24h;最后入辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素復(fù)合物(S-A/HRP)中室溫孵育 2h;以上每一步驟之后均用 0.01 mol/L PBS液充分漂洗 3次,每次 10 min;用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸鎳胺法呈色反應(yīng) 15 min。染色的切片漂洗后裱片、晾干、脫水、透明、封固。每批染色設(shè)置空白對照以 PBS緩沖液代替一抗進(jìn)行。③圖像分析:在明視野顯微鏡下認(rèn)定 mPFC結(jié)構(gòu)單位,以含棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞,經(jīng) HPLAS-100型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)在高倍鏡下計(jì)數(shù) m PFC的陽性細(xì)胞,結(jié)合 Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì),每組標(biāo)本取 5個(gè)(距前囟 3.2mm)陽性表達(dá)部位測定后取平均值。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用方差分析(One-way ANOV A);放電頻率的比較使用 Student’s t檢驗(yàn),變異系數(shù)的比較使用Mann-Whitney U檢驗(yàn),放電形式的比較使用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 對照組和 PD組大鼠 mPFC錐體神經(jīng)元電活動(dòng)的比較 對照組大鼠 mPFC錐體神經(jīng)元的放電頻率為 1.25± 0.09Hz(n=32),變異系數(shù)為 0.54± 0.05,其放電形式表現(xiàn)為不規(guī)則放電和爆發(fā)式放電兩種,前者占 78%,后者占 22%。PD組大鼠 mPFC錐體神經(jīng)元放電頻率為 2.41± 0.19Hz(n=48),變異系數(shù)是 0.76±0.06,放電形式同樣為兩種,68%為爆發(fā)式放電,32%為不規(guī)則放電。與對照組相比,PD組的放電頻率明顯增加,變異系數(shù)明顯增高,爆發(fā)式放電比例顯著升高。 見圖 1。

圖1 對照組與 PD組大鼠 mPFC內(nèi)神經(jīng)元放電頻率和放電形式的比較

圖2 5-HT1A受體細(xì)胞內(nèi)的分布 (×400)

圖3 大鼠 mPFC神經(jīng)元 5-HT1A表達(dá)(×200)

圖4 對照組和 PD組大鼠 mPFC的分層情況Ⅰ～Ⅵ (×200)

2 大鼠 mPFC5-HT1A受體表達(dá)的變化 大鼠mPFC中 5-HT1A受體的表達(dá)主要集中在 5-HT能神經(jīng)元的胞體和樹突上,見圖 2。對照組大鼠 mPFC部位表達(dá)比較豐富的 5-HT1A陽性細(xì)胞,而 PD模型大鼠損毀側(cè) m PFC部位 5-HT1A受體陽性細(xì)胞則明顯稀疏,與對照組相比具有顯著性差異(P＜0.05),見圖 3。大鼠 mPFC錐體神經(jīng)元各層 5-HT1A受體表達(dá)的變化顯示,對照組大鼠和 PD組大鼠 m PFC的Ⅰ層均無5-HT1A受體的表達(dá),對照組大鼠 m PFC的Ⅱ～Ⅵ層5-HT1A受體陽性細(xì)胞表達(dá)比較豐富,PD組大鼠mPFC的Ⅱ?qū)?5-HT1A受體陽性細(xì)胞表達(dá)也較豐富,但Ⅲ～Ⅵ表達(dá)明顯稀疏。見圖 4。

3 大鼠 mPFC內(nèi) 5-HT1A受體陽性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較 PD模型大鼠損毀側(cè) mPFC內(nèi) 5-HT1A受體陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目明顯減少,與未損毀側(cè)及正常對照組和相比均有顯著差異(P＜0.05),而未損毀側(cè)mPFC內(nèi) 5-HT1A受體陽性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)與正常對照組相比無明顯變化(P＞0.05)。見附表。

附表 各組大鼠 mPFC5-HT1A受體陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

附表 各組大鼠 mPFC5-HT1A受體陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

注:對照組與 PD組比較 P＜0.05

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討 論

已知 mPFC在情緒調(diào)節(jié)和認(rèn)知活動(dòng),特別是注意力和記憶過程起重要作用。mPFC中有高密度的 5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體和多種 5-HT受體亞型表達(dá)[5],以 5-HT1A受體亞型居多。5-HT1A受體位于胞體和樹突上,具有自身受體的特性,對遞質(zhì)的釋放和神經(jīng)元的活動(dòng)起著復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用[6]。 5-HT1A受體通過 G蛋白和 K+離子通道相耦聯(lián),使神經(jīng)元產(chǎn)生超極化,從而抑制神經(jīng)元的電活動(dòng)[7,8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 SNc偏側(cè)損毀后大鼠損毀側(cè)m PFC內(nèi) 5-HT1A受體陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)目明顯減少,其原因可能為黑質(zhì)-紋狀體通路變性導(dǎo)致 m PFC內(nèi) 5-HT1A受體缺失或表達(dá) 5-HT1A受體的神經(jīng)元變性死亡。Frechilla報(bào)道在 MPTP誘導(dǎo)的 PD猴子模型中,m PFC和海馬腦區(qū)的 5-HT1A受體密度,以及細(xì)胞外5-HT遞質(zhì)濃度都有所降低,在 PD患者和 M PT P誘導(dǎo)的 PD猴子模型中,縫核、前額葉皮層和海馬結(jié)構(gòu)中5-HT1A受體的結(jié)合位點(diǎn)明顯降低[9]。我們的研究結(jié)果與其一致。這些均證實(shí)了黑質(zhì)-紋狀體通路變性可導(dǎo)致 5-HT遞質(zhì)系統(tǒng)發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的改變,包括 5-HT能神經(jīng)元的減少和多種 5-HT受體亞型的功能失調(diào)。本實(shí)驗(yàn)觀察到 PD組大鼠 mPFC的Ⅰ層與對照組相同,均無 5-HT1A受體的表達(dá),而 PD組Ⅲ -Ⅵ層 5-HT1A受體陽性細(xì)胞表達(dá)明顯稀疏,提示在 PD狀態(tài)下 mPFC的Ⅲ -Ⅵ層內(nèi) 5-HT1A受體缺失或表達(dá)受體的神經(jīng)元變性死亡受損最為明顯。

本研究顯示,6-OHDA損毀大鼠的 SNc后,mPFC錐體神經(jīng)元放電頻率明顯增多,放電形式趨向爆發(fā)式放電,說明 PD狀態(tài)下 mPFC錐體神經(jīng)元呈過度電活動(dòng),其原因可能為,mPFC主要接受腹側(cè)被蓋區(qū)的 DA神經(jīng)纖維傳入,并且表達(dá) D1和 D2受體。Carman等發(fā)現(xiàn)損毀大鼠的 SNc后,腹側(cè)被蓋區(qū)中的 DA能神經(jīng)元平均丟失 32%[10]。 因此,6-OHDA損毀 SNc后,導(dǎo)致了腹側(cè)被蓋區(qū)中 DA能神經(jīng)元的變性,從而使 mPFC錐體和中間神經(jīng)元上 DA受體表達(dá)減少,導(dǎo)致了錐體神經(jīng)元的去抑制。其次,m PFC中 50%～ 60%的錐體神經(jīng)元和 20%～30%的中間神經(jīng)元上有 5-HT1A受體的表達(dá)。5-HT1A受體通過 G蛋白與 K+通道耦聯(lián),激活 5-HT1A受體,使細(xì)胞膜產(chǎn)生超極化,從而降低神經(jīng)元的活動(dòng)。刺激縫核和中縫背核可以通過激活 5-HT1A受體而抑制 mPFC中錐體神經(jīng)元的電活動(dòng)[11],黑質(zhì)-紋狀體通路變性導(dǎo)致 mPFC中 5-HT1A受體表達(dá)下降,進(jìn)而導(dǎo)致錐體神經(jīng)元的電活動(dòng)增強(qiáng)。因此,我們推測腹側(cè)被蓋區(qū)中 DA能神經(jīng)元的喪失、m PFC中DA含量降低和 5-HT1A受體表達(dá)的減少,與錐體神經(jīng)元的電活動(dòng)增強(qiáng)密切相關(guān)。我們課題組的研究還顯示[12],與對照組大鼠相比,在 PD組大鼠,體循環(huán)給予選擇性 5-HT1A受體激動(dòng)劑 8-OH-DPAT只有在高劑量時(shí)才能夠抑制錐體神經(jīng)元的放電頻率,并且沒有興奮-抑制作用的出現(xiàn);mPFC中局部應(yīng)用 8-OH-DPAT不能改變神經(jīng)元的電活動(dòng)。這些結(jié)果進(jìn)一步支持黑質(zhì)-紋狀體通路變性導(dǎo)致了 5-HT1A受體功能失調(diào)或 /和受體表達(dá)的降低。因此,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助我們更為深入的理解 PD狀態(tài)下 mPFC的作用,以及 5-HT系統(tǒng)在PD非運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)癥狀的發(fā)生機(jī)制和病理生理變化、以及進(jìn)一步尋找有效治療手段方面具有重要的作用。

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