氟對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡與caspase-3表達(dá)的影響

張 斌， 郭 民， 王海龍， 宋國(guó)華 (山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 太原 030001;通訊作者，E-mail:ghsongg@yahoo.com.cn)

細(xì)胞凋亡即程序性細(xì)胞死亡，是多細(xì)胞生物更新正常細(xì)胞和清除異常細(xì)胞的重要手段。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)在凋亡信號(hào)傳遞中起關(guān)鍵作用，甚至有人認(rèn)為它是凋亡的執(zhí)行者［1］。氟對(duì)雄性生殖系統(tǒng)有毒性作用，可直接作用于睪丸、附睪、前列腺等，破壞其結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致生育能力的下降［2］。研究表明間質(zhì)細(xì)胞受損，線粒體和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化顯著，可能通過(guò)增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，抑制物質(zhì)和能量代謝過(guò)程，損傷DNA等途徑對(duì)雄性生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能造成直接損害［3］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察氟化鈉對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行染毒，觀察間質(zhì)細(xì)胞凋亡以及caspase-3表達(dá)的變化，進(jìn)一步證實(shí)氟化鈉對(duì)間質(zhì)細(xì)胞的毒性作用，為氟中毒的雄性生殖系統(tǒng)損傷機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞。取睪丸間質(zhì)細(xì)胞，待細(xì)胞單層長(zhǎng)滿95%左右后，將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液棄掉，先用1 ml左右的消化液潤(rùn)洗培養(yǎng)瓶，棄去消化液，再加2 ml左右新鮮的消化液，當(dāng)單層細(xì)胞呈白色，細(xì)胞間出現(xiàn)裂縫且細(xì)胞開(kāi)始收縮時(shí)棄掉消化液，終止消化;加入10 ml DMEM/F12培養(yǎng)基，用吸管吹打散開(kāi)。將一瓶傳兩瓶，如果生長(zhǎng)不好，濃度不高，但又需要傳代時(shí)也可采用原瓶傳原瓶的方式。傳代后幾小時(shí)就可以觀察到先貼壁的間質(zhì)細(xì)胞，表示傳代成功。傳代細(xì)胞培養(yǎng)溫度條件為37℃，密封培養(yǎng)。取第3代睪丸間質(zhì)細(xì)胞接種于蓋玻片上，細(xì)胞接種密度為1×106個(gè)/ml，待細(xì)胞長(zhǎng)至匯合后取出蓋玻片，以常規(guī)3β-HSD法染色鑒定。

1.2 主要試劑和儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青公司);胰蛋白酶(Gibco公司);膠原酶(Sigma公司);超凈工作臺(tái)(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);CO2培養(yǎng)箱(Forma scientific美國(guó));超低溫冰箱(Sanyo公司);氟化鈉(分析純，天津化學(xué)試劑廠);Annexin-Ⅴ-FITC(Sigma公司);casepase-3試劑盒(武漢博士德生物公司)。

1.3 染毒處理 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖形成單層細(xì)胞，鏡下觀察以1×106/ml接種于預(yù)置玻片的6孔培養(yǎng)板，每孔1 ml。48 h后棄舊培養(yǎng)液，PBS洗滌后換為含不同濃度氟化鈉的培養(yǎng)液，參考毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)一般進(jìn)行低、中、高劑量染毒和氟化鈉對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的研究［4］，本實(shí)驗(yàn)氟化鈉的濃度設(shè)為 0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L和20 mg/L。37℃恒溫混合氣體(5%CO2和95%O2)環(huán)境中培養(yǎng)，隔天換液。于不同時(shí)間在倒置顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化。1.4 睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的測(cè)定 各組細(xì)胞每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)重復(fù)組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化并離心收集各組細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞3次;1×binding buffer重新懸浮細(xì)胞至1×106/ml;取100 μl細(xì)胞至5 ml管;加入5 μl Annexin-Ⅴ-FITC，5 μl碘化丙錠(PI)混勻;于室溫避光孵育15 min;每管加入300 μl 1 × binding buffer，1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度［5］。

1.5 caspase-3蛋白表達(dá)的測(cè)定 調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/ml;將細(xì)胞培養(yǎng)于載玻片，載玻片置于6孔板內(nèi)，先生長(zhǎng)約4 h，使細(xì)胞貼壁后再小心加入培養(yǎng)基3 ml，常規(guī)培養(yǎng)48 h，選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

分組:PBS洗滌后換為含不同濃度氟化鈉(0 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，20 mg/L)的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

固定:氟作用48 h后，用PBS(pH 7.2)緩慢沖洗3次，倒掉PBS，加入4%多聚甲醛室溫下固定30 min，蒸餾水沖洗3次，每次2 min，取出載玻片。30%H2O21份+蒸餾水10份混合，室溫5－10 min以滅活內(nèi)源性酶;蒸餾水洗3次。滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體。加入caspase-3適當(dāng)稀釋的一抗(1∶100)，37℃30 min，然后4℃過(guò)夜;加入二抗4℃過(guò)夜后取出，室溫放置10 min，PBS洗3次，每次5 min;滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37 ℃ 20 min。PBS(pH7.2－7.6)洗2 min×3次。滴加SABC，20－37℃ 20 min。PBS(pH7.2－7.6)洗5 min×4次。

DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒(AR1022)。取1 ml蒸餾水，加試劑盒中A，B，C試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，至出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性顆粒時(shí)，蒸餾水洗滌。

蘇木素復(fù)染細(xì)胞核10 min，1%鹽酸酒精分化，鏡下控制，自來(lái)水返藍(lán)10 min;脫水、透明:70%、80%、90%、100%、100%酒精各 5 min，二甲苯 10 min;封片:中性樹(shù)膠封片。

1.6 顯微圖像分析 在光學(xué)顯微鏡OlympusAX70下觀察切片，從每組中選取8－10張切片，每張切片隨機(jī)選取5－7個(gè)視野，利用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)將圖像采集并轉(zhuǎn)化到計(jì)算機(jī)中，通過(guò)MetaMorph4.5圖像分析軟件自動(dòng)測(cè)定每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞的灰度值，并計(jì)算其平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以±s表示，方差齊的多組比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氟對(duì)體外培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響

在倒置顯微鏡下觀察時(shí)，實(shí)驗(yàn)組(5，10，20 mg/L)24 h內(nèi)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增多，形態(tài)變化不明顯;從24 h開(kāi)始細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始少于正常對(duì)照組，細(xì)胞數(shù)量顯著下降，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，睪丸間質(zhì)細(xì)胞呈明顯的長(zhǎng)梭形、星形，細(xì)胞收縮變形，細(xì)胞間隙增大。各處理組隨著氟濃度的增高和時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的變化逐漸明顯。對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞形態(tài)自然。

2.2 氟誘導(dǎo)體外培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)不同濃度氟化鈉(0 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，20 mg/L)染毒48 h后，間質(zhì)細(xì)胞凋亡結(jié)果見(jiàn)表1和圖1，各實(shí)驗(yàn)組與同期對(duì)照組比較差異顯著(P ＜0.01)。結(jié)果表明，5，10，20 mg/L 的氟作用于小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞均可誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡。20 mg/L氟作用48 h后，早期凋亡率最高，10 mg/L氟作用48 h后，晚期凋亡率最高，染氟各組小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡率高于同期對(duì)照組(P＜0.01)。各染氟小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡率隨染氟劑量的增加逐漸升高。結(jié)果提示，一定劑量的氟化鈉能引起小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡率的升高。

表1 不同濃度氟化鈉干預(yù)48 h的間質(zhì)細(xì)胞的凋亡率(±s)Tab 1 Leydig cell apoptosis rate after treated with different concentrations of sodium fluoride for 48 h(±s)

表1 不同濃度氟化鈉干預(yù)48 h的間質(zhì)細(xì)胞的凋亡率(±s)Tab 1 Leydig cell apoptosis rate after treated with different concentrations of sodium fluoride for 48 h(±s)

與同期0 mg/L(對(duì)照組)比較，*P＜0.01

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2.3 氟對(duì)體外培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞caspase-3表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組染色細(xì)胞數(shù)少且著色淺，睪丸間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)少量棕黃色顆粒，表明caspase-3表達(dá)弱;5 mg/L組睪丸間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)較多的棕黃色顆粒沉積，caspase-3表達(dá)強(qiáng);10 mg/L和20 mg/L組細(xì)胞核周圍均被染成棕黃色(見(jiàn)圖2)，caspase-3強(qiáng)表達(dá)。caspase-3在睪丸間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，隨著氟濃度的增高，間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒也增多。圖像分析結(jié)果說(shuō)明caspase-3灰度值在20 mg/L組低于10 mg/L組。由此可見(jiàn)，隨著氟濃度的增加，灰度值降低。因此，氟濃度與caspase-3灰度值呈負(fù)相關(guān)，即陽(yáng)性率越高，灰度值越低，蛋白表達(dá)越強(qiáng)。

圖1 不同濃度氟化鈉干預(yù)48 h的間質(zhì)細(xì)胞的凋亡率Fig 1 The apoptosis of Leydig cell after treated with different concentrations of sodium fluoride for 48 h by flow cytometry

表2 不同濃度氟化鈉組caspase-3表達(dá)的平均灰度值(±s，n=30)Tab 1 Average gray value of caspase-3 expression after treated with different concentrations of sodium fluoride(±s，n=30)

表2 不同濃度氟化鈉組caspase-3表達(dá)的平均灰度值(±s，n=30)Tab 1 Average gray value of caspase-3 expression after treated with different concentrations of sodium fluoride(±s，n=30)

與0 mg/L(對(duì)照組)比較，*P ＜0.01

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3 討論

細(xì)胞凋亡既是間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育中的重要方式，又是致畸因素導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞異常發(fā)育的重要形式［6，7］。因此，細(xì)胞凋亡的研究有助于間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育機(jī)制的闡明。實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)方式，用氟化鈉染毒，觀察其對(duì)小鼠間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響，這樣可以排除動(dòng)物個(gè)體因素的干擾。結(jié)果在對(duì)照組和低高劑量氟化鈉組均觀察到亞二倍體峰值的顯著變化(P＜0.01)，說(shuō)明存在細(xì)胞凋亡。同時(shí)也證實(shí)氟化鈉隨著濃度的增加，細(xì)胞凋亡也增強(qiáng)，因?yàn)閬喍扼w峰值高劑量氟化鈉組與空白對(duì)照組和低劑量氟化鈉組相比均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖2 caspase-3的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞形態(tài)(免疫組織化學(xué)染色，×200)Fig 2 Caspase-3 positive expression in each group(immunohistochemical staining，×200)

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞受死亡信號(hào)刺激后發(fā)生的主動(dòng)性細(xì)胞死亡過(guò)程。凋亡不足時(shí)，易發(fā)生自身免疫性疾病、病毒性疾病和癌變等，這個(gè)過(guò)程涉及到多個(gè)家族的蛋白質(zhì)。目前已證明caspase家族在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制中起關(guān)鍵作用，是多條凋亡通路的匯聚點(diǎn)，是執(zhí)行凋亡的最終途徑。在caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，caspases-3處于核心位置。caspases-3被其上游信號(hào)激活，活化的caspases-3又進(jìn)一步作用于其底物導(dǎo)致 caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大，最終使細(xì)胞凋亡［8］。有研究報(bào)道關(guān)于氟對(duì)大鼠成骨細(xì)胞中與凋亡密切相關(guān)的caspase家族的兩個(gè)基因caspase-3和caspase-9基因mRNA表達(dá)量的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)染氟24 h后，氟的刺激沒(méi)有引起caspase-3和caspase-9基因mRNA表達(dá)量的變化，當(dāng)氟作用72 h后，5 mg/L NaF組的caspase-3和caspase-9基因mRNA表達(dá)量明顯升高，分別是對(duì)照組的2.03和2.23倍，推斷氟導(dǎo)致細(xì)胞色素C與Apaf-1激活，然后進(jìn)一步激活caspase-9，進(jìn)而激活 caspase-3最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［4］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組睪丸間質(zhì)細(xì)胞中，caspase-3表達(dá)都呈陽(yáng)性;但與0 mg/L組相比，5 mg/L組氟化鈉組睪丸間質(zhì)細(xì)胞中caspase-3表達(dá)的平均灰度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而與0 mg/L組和5 mg/L氟化鈉組相比，高劑量氟化鈉組caspase-3表達(dá)的平均灰度值均存減少。結(jié)果證實(shí)了caspase-3是睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的重要的細(xì)胞因子之一，參與正常和異常間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育調(diào)節(jié)。同時(shí)也證實(shí)了隨著氟化鈉濃度的增加，細(xì)胞凋亡也增強(qiáng)。

有報(bào)道認(rèn)為caspase半胱氨酸蛋白酶家族引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡過(guò)程的中心環(huán)節(jié)，其激活主要包括線粒體依賴途徑和死亡受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，激活后的下游caspase通過(guò)切割特異性底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。其中caspase-3處于caspase蛋白酶系的核心地位，可作用于多種底物，其底物改變與細(xì)胞凋亡表型密切相關(guān)，在caspase酶系級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［9，10］。那么，氟化鈉通過(guò)何種方式激活caspases前體蛋白，還需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一步探討。

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