不同大豆品種醇溶蛋白亞基累積與品質(zhì)的關(guān)系

冀華,張樹偉,趙晉忠

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院,山西 太谷030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太谷030801)

大豆含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白,是植物蛋白的重要來源。大豆蛋白占世界蛋白總量的三分之二以上,它與其他植物蛋白相比是一種氨基酸組成均衡的優(yōu)質(zhì)蛋白,與動(dòng)物蛋白相比,具有膽固醇含量低的優(yōu)點(diǎn),同時(shí)大豆蛋白還具有預(yù)防心血管疾病和抗高血壓的保健功能[1,2]。某些大豆食品的品質(zhì)與大豆種子蛋白的組分有關(guān),裴東風(fēng)等[3]研究表明,子粒谷蛋白含量低的品種豆腐產(chǎn)量高,醇溶蛋白高的品種豆腐產(chǎn)量高。周新安等[4]報(bào)道,醇溶蛋白含硫氨基酸高。關(guān)于大豆種子發(fā)育過程中貯存蛋白的積累已有許多報(bào)道。Hill[5],Beachy[6]等人對(duì)大豆發(fā)育過程中貯存蛋白在組分上的變化,以及基因表達(dá)的調(diào)控方面做了許多研究;鄭易之[7]等人、林忠平[8]等人對(duì)大豆種子發(fā)育過程中11S和7S蛋白的積累時(shí)間進(jìn)程進(jìn)行過研究。但對(duì)不同時(shí)期大豆醇溶蛋白亞基的積累變化還未見報(bào)道。本研究以早晚熟大豆品種為材料,利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)不同時(shí)期大豆籽粒中的醇溶蛋白進(jìn)行分析,找出不同醇溶蛋白亞基積累的劇增期,為改善大豆品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料

早熟品種晉大75(生育期為110 d),晚熟品種國審晉大53(生育期為135 d)。

2 方法

2.1 取材方法

調(diào)整播期,使兩個(gè)品種的的開花期一致。從開花期7月5日進(jìn)行掛牌標(biāo)記,開花后15 d即7月20號(hào)開始取樣,每5 d取樣一次,直至各品種成熟為止。每次取樣后于80℃殺青,105℃烘干保存。

2.2 脫脂方法

大豆種子去皮,置于經(jīng)滅菌的濾紙間,碾碎成粉末,取0.2 g大豆粉,置于1.5 mL離心管中,加脫脂液(氯仿∶甲醇∶丙酮=2∶1∶1)1 mL,4℃以下脫脂4 h(中間換兩次脫脂液),室溫下風(fēng)干備用。

2.3 醇溶蛋白的提取方法

稱取30 mg脫脂大豆粉,加入0.3 mL70%乙醇,旋渦振蕩10 min,室溫下放置2 h或過夜,5000 r?min-1離心10 min,加入冷丙酮(-40℃),12 000 r?min-1離心2 min,傾去上清液,室溫下風(fēng)干剩余的丙酮后,加 0.1 mL樣品溶解液(pH7.6,0.035 mol?L-1磷酸緩沖液50 mL+0.5 gSDS+0.5 mL巰基乙醇+5 mL甘油+0.02 g溴酚藍(lán)),供點(diǎn)樣用。

2.4 電泳方法

采用SDS-PAGE垂直板非連續(xù)系統(tǒng),醇溶蛋白分離膠的濃度為12.5%,濃縮膠的濃度為3%[4,9～11]。膠板采用銀染法[9]。

3 結(jié)果與分析

3.1 晉大75醇溶蛋白亞基積累的分析

晉大75醇溶蛋白不同積累時(shí)期顯示的亞基帶見表1。

表1 不同時(shí)期晉大75醇溶蛋白顯示的蛋白亞基帶Table 1 Prolamine subunits of jinda75 at different accumulating period

由圖1和表1可以看出,(1)不同亞基的積累情況存在差異,某些亞基(如 A2、A3、C1和D1)從開始積累到最后,中間過程亞基帶的深淺有變化;某些亞基(如 A1、B2 、B8、C2 、C3、C4、C5 、D2)主要在后期積累,而且亞基帶較濃;某些帶(如B1、B3、B4、B7)從開始積累,到最后時(shí)期消失;某些帶(B5、D3)只在中間某段時(shí)期出現(xiàn)(見表1)。(2)B區(qū)蛋白亞基變化比較明顯,B1、B3、B4從開花后15 d就積累濃的亞基帶,到開花后60 d又消失,同時(shí)出現(xiàn)濃的B2亞基帶。B5在開花后60 d出現(xiàn)之后又消失,B5亞基是某種酶還是功能性亞基有待于進(jìn)一步研究。(3)D3在開花后45 d積累濃帶,之后變淺,最后消失,這些亞基是否為功能性蛋白亞基,在蛋白積累的過程中起什么作用有待于進(jìn)一步研究。(4)晉大75醇溶蛋白的劇增期在開花后45～60 d。

圖1 晉大75醇溶蛋白積累的SDS電泳圖譜Fig.1 SDS gel electrophoreetic profiles for the accumulation of prolamine of jinda75

3.2 晉大53醇溶蛋白亞基積累的分析

見表2。

表2 晉大53醇溶蛋白顯示的亞基帶Table 2 Prolamine subunits of jinda53 at different accumulating period

由表2可知,(1)晉大53在A′區(qū)出現(xiàn)的蛋白亞基帶比晉大75多,但最后成為貯存蛋白亞基只有A′2。(2)晉大53在A區(qū)出現(xiàn)的蛋白亞基帶比晉大75少,同時(shí)晉大53的A區(qū)帶在開花后35 d積累較濃帶,之后消失,到開花后75d迅速積累濃帶。(3)B區(qū)的B1、B2、B3、B4積累比較穩(wěn)定,從開始到最后都出現(xiàn)濃帶,中間時(shí)期帶的深淺有變化。B6、B7、C2、D2、D4只在中間某個(gè)時(shí)期出現(xiàn)一條帶,這可能是某種酶或某種功能性蛋白,它們?cè)趦?chǔ)藏蛋白的積累過程中起一定作用。同時(shí),晉大53在C區(qū)、D區(qū)積累的蛋白亞基帶不如晉大75濃。(4)晉大53醇溶蛋白的劇增期在開花后40～50 d、70～75 d。

3.3 晉大75和晉大53醇溶蛋白亞基積累的比較分析

結(jié)合表1、表2以及圖 1、圖2可知,(1)早晚熟品種各區(qū)亞基的積累情況不一樣,早熟品種晉大75的A區(qū)帶在開花后15～20 d開始積累,且開花后45～60 d開始大量積累。而晚熟品種晉大53的A區(qū)帶在開花后35～40 d開始合成積累,到開花后70 d含量突然增高,這就說明A區(qū)蛋白的積累主要在后期,而且早熟品種比晚熟品種提前10～15 d。(2)B、C、D區(qū)蛋白亞基積累情況基本一致,都是在開花后15 d開始積累,個(gè)別亞基積累時(shí)間存在差異。(3)早晚熟品種的醇溶蛋白劇增期不同,晉大75在開花后45～60 d,晉大53在開花后40～50 d、70～75 d。

圖2 晉大53醇溶蛋白積累的SDS電泳圖譜Fig.2 SDS gel electrophoreetic profiles for the accumulation of prolamine of jinda5

4 討論

4.1 蛋白亞基積累的變化規(guī)律及其與品質(zhì)的關(guān)系

關(guān)于大豆子葉中7S和11S球蛋白積累的時(shí)間進(jìn)程已有許多報(bào)告[7,8,12,13],但對(duì)醇溶蛋白亞基積累的研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)早熟和晚熟品種醇溶蛋白的積累進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)(1)早晚熟品種高分子量醇溶蛋白亞基(B、C、D區(qū))積累的情況基本一致,從開花后15 d就開始合成積累。不同亞基的積累規(guī)律不同,在合成積累的時(shí)間順序上存在差異。(2)低分子量醇溶蛋白亞基(A′、A區(qū))主要在后期積累,一般情況早熟品種7S醇溶蛋白積累時(shí)間比晚熟品種提前15～20 d。上述規(guī)律是否具有普遍性還有待于進(jìn)一步研究。

此外,對(duì)醇溶蛋白進(jìn)行研究,對(duì)于大豆品質(zhì)的改善具有重要意義。(1)早晚熟品種醇溶蛋白積累的劇增期不同。如晉大75醇溶蛋白的劇增期在開花后45～60 d。晉大53醇溶蛋白的劇增期在開花后40～50 d和70～75 d。(2)明確醇溶蛋白的劇增期以及亞基的積累過程,對(duì)于改善這種蛋白的品質(zhì)十分重要[8,14-17]。如根據(jù)周新安等[4]報(bào)道的醇溶蛋白含硫氨基酸高,就可以在醇溶蛋白的劇增時(shí)期,滿足蛋白合成需要的物質(zhì)供應(yīng),而達(dá)到改善種子中醇溶蛋白的數(shù)量和質(zhì)量。

4.2 脫脂方法的探討

大豆種子中的脂肪含量高,達(dá)20%左右。因此,脫脂的好壞直接影響電泳結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)開始采用正己烷脫脂,脫脂時(shí)間長而且脫脂不徹底。而采用氯仿:丙酮:甲醇=2∶1∶1作為脫脂液,縮短了脫脂時(shí)間(只需2～4 h,中間更換一次脫脂液),但時(shí)間不能過長,同時(shí)要求整個(gè)脫脂過程在低溫(4℃以下)進(jìn)行,否則會(huì)損失部分醇溶蛋白和少部分球蛋白。本實(shí)驗(yàn)采用后者進(jìn)行脫脂,基本上消除了脂肪對(duì)電泳結(jié)果的影響,效果比較理想。

[1]Ham.J.O.,chapman,K.M.,et al.,Endocrinological response to soy protein and fiber in mildly hypercholesterolemic men[J].Nutr.Res.1993,13:873-884.

[2]Kawamura Y.Food protein and Antihypertension in proceedings,of Sino-Japanese Workshop on Advanced Food Technologyed[D].Beijing:China Agricultural university,1997.

[3]裴東紅,余建章,程國華,等.不同大豆品種豆腐產(chǎn)量的研究[J].大豆科學(xué),1995,14(1):13-20.

[4]周新安,蓋鈞鎰,馬育華.大豆種子貯存蛋白組成極其相關(guān)分析[J].大豆科學(xué),1992,11(3):191-197.

[5]Hill,J.E.and R..W.Breidenbach.Protein of soybean seeds II.Accumulation of the major protein components during seed development and maturation[J].Plant Physiol.,1974,53:747-751.

[6]Beachy R.N.et al.Biosynthesis of subunits of the soybean 7S storage protein[J].J.Mol.Appl.Genet,1981,1:19-24.

[7]鄭易之,何孟元,郝水.大豆子葉蛋白體的形成與儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)積累的關(guān)系[J].植物學(xué)報(bào),1992,34(8):641-644.

[8]林忠平,崔慶玲,趙玉錦,等.利用免疫熒光法研究大豆種子發(fā)育過程中11S和7S蛋白的積累[J].中國科學(xué)(B輯),1989(3):285-288.

[9]張龍翔,張庭芳,李令媛.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,2001:252-259.

[10]桑建利,王玉秀,朱玉清.小麥體細(xì)胞無性系種子醇溶蛋白和谷蛋白的變異[J].植物學(xué)報(bào),1992,34(11):845-849.

[11]郭堯君.SDS電泳技術(shù)的實(shí)驗(yàn)考慮及最新進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1991(1):32-37.

[12]Gayler,K.R.and G.E.Skyes,β-conglycinins in developing soybean seeds[J].Plant Physiol,1981,67:958-961.

[13]Ochiai-Yanagi,S.,C.Fukazawa and K.Harada.Formation of storage protein components during soybean seed development[J].Agric.Biol.Chem.,1978,42:697-702.

[14]杜金哲,胡尚連,李文雄,等.不同品質(zhì)類型春小麥HMW-GS形成時(shí)間和積累強(qiáng)度及與品質(zhì)的關(guān)系[J].作物學(xué)報(bào),2003,29(1):111-118.

[15]Liu X B(劉曉冰).Accumulation and regulation of grain starch,protein and its fraction during grain filling of wheat genotypes differing in protein content and baking quality,Dissertation(Supervisor:Professor Li Wen-xiong)[D].Northeast Agricultural University,Harbin,China.1994.

[16]韓天富,王金陵,楊慶凱,等.開花后光照長度對(duì)大豆化學(xué)品質(zhì)的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),1997,30(2):47-53.

[17]楊慶凱.論大豆蛋白與油分含量品質(zhì)的變化及影響因素[J].大豆科學(xué),2000,19(4):386-391.