致仔豬水腫病大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

李求知,杭柏林,王青,胡建和

（1.輝縣市畜牧局,河南輝縣 453600；2.河南科技學院,河南新鄉(xiāng) 453003）

豬水腫病（edema disease of pigs,ED）,是由某些特定血清型產(chǎn)類志賀毒素大腸桿菌（Shiga-like toxinEscherichia coli,SLTEC）引起的小豬的一種腸毒血癥,以頭部、眼瞼、耳部等處水腫、共濟失調(diào)和急性死亡為主要特征[1-2].該病發(fā)病率不高,但病死率很高,給豬的養(yǎng)殖造成很大損失,成為危害養(yǎng)殖業(yè)的一大難題[2].仔豬水腫病病原血清型較多,各地流行菌株不盡相同,血清型之間的交叉保護性不高,菌苗的免疫效果并不理想.因此,一般通過抗生素治療仔豬水腫病.然而,不合理使用抗生素易導致細菌產(chǎn)生耐藥性,使得治療越發(fā)困難[3].2010年6月至8月,輝縣市幾個豬場出現(xiàn)了斷奶仔豬突然死亡的病例,從病豬的臨床癥狀和剖檢病變方面初步診斷為仔豬水腫病.為了確診該病,進行了病原分離與鑒定,并進行了耐藥性檢測,旨在為防治該病提供幫助.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料采集 肝、脾、肺、心、血液等病料采集自輝縣市幾個豬場的疑似仔豬水腫病病死豬,共16份病料.用保溫杯加冰袋冷藏保存,并于3 h內(nèi)送達實驗室,保存于4℃,24 h待檢.

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂、微量生化反應管等購自杭州天和微生物試劑有限公司.藥敏紙片、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和枸櫞酸鹽培養(yǎng)基為本實驗室自行制備并保存,各種抗生素購自河南科技學院動物醫(yī)院,TaqDNA聚合酶、dNTPs、Taq buffer和DNAMarker等均為大連寶生物公司產(chǎn)品.其他為實驗室常規(guī)試劑.

1.1.3 試驗動物 22只試驗用小白鼠（16～20 g）購自新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心.

1.1.4 PCR引物的設計及合成 使用文獻[4]設計的特異性引物,序列見表1,引物由大連寶生物公司合成.

表1 引物序列

1.2 試驗方法

1.2.1 臨床癥狀及病理變化的觀察 臨床癥狀主要觀察發(fā)病豬的精神狀態(tài)、食欲、體溫、呼吸、運動等情況；病理變化的觀察通過解剖病、死豬,觀察胃底黏膜、胃大彎、胃賁門部、心包、胸腔、腹腔等的病理變化情況.

1.2.2 細菌的分離 將血液用滅菌生理鹽水進行稀釋,取不同稀釋度的稀釋液0.5mL,用涂布法接種普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基.心、肝、肺和脾臟用剪刀以燙灼法進行表面消毒,以無菌鑷子取一小塊組織,用涂布法接種普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基.37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后觀察細菌生長情況和菌落特征.挑取單個菌落接種于麥康凱瓊脂平板,37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h,挑取紅色、中等大小、光滑的可疑菌落進行涂片、革蘭染色和鏡檢.同時挑取單個菌落接種于伊紅美藍瓊脂平板,37℃培養(yǎng)18～24 h,挑取黑色、帶金屬光澤的中等大小菌落進行涂片、革蘭染色和鏡檢.革蘭染色、形態(tài)、大小及菌落培養(yǎng)性狀等均符合大腸桿菌菌株的特征,初步確定為大腸桿菌,并用普通營養(yǎng)瓊脂純化,以供作細菌生理生化鑒定.

1.2.3 細菌生化試驗 按照文獻[5]的方法進行.對疑似大腸桿菌的菌株進行吲哚試驗、甲基紅試驗、維倍（VP）試驗、硫化氫（H2S）試驗、枸櫞酸鹽利用試驗和5種糖類發(fā)酵試驗.

1.2.4 細菌致病性試驗 為了鑒定所分離的大腸桿菌是否具有致病性,使用小白鼠進行動物試驗.按照文獻[6]的方法進行.將生化鑒定為大腸桿菌陽性的菌株純培養(yǎng)物接種普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)18～24 h,用滅菌生理鹽水洗下,調(diào)節(jié)菌懸液的細菌濃度約為2.0×108CFU/mL,通過腹腔途徑注射5只健康小白鼠0.5 mL/只.對照組小白鼠注射等量的滅菌生理鹽水.小白鼠死亡后進行剖檢觀察,將病變明顯組織按方法1.2.1中心包、肝臟和脾臟的方法進行接種,若培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色反應和生理生化鑒定等均符合大腸桿菌的菌株則判定為致病性大腸桿菌.

1.2.5 菌落PCR 按照文獻[4]的方法進行.用滅菌牙簽輕輕從麥康凱培養(yǎng)基上挑取于37℃培養(yǎng)16～18 h、中等大小、粉紅色典型菌落于PCR反應體系中混勻,直接用于PCR擴增.反應體系：模板為牙簽挑取的適量菌落,Taq酶（2U/L）0.5μL,dNTPs（2mmo1/L）1μL,MgC12（25mmo1/L）1.0μL,10×Taq buffer（不含Mg2+）2μL,各對引物中每種引物 1.0μL（10μmol/L）,加滅菌雙蒸水至 20μL.反應步驟：95℃4min,94℃lmin,58℃lmin,72℃lmin,25個循環(huán)后,72℃延伸l0min,4℃保存待鑒定.

取5μL擴增產(chǎn)物與1/6體積的DNA電泳上樣緩沖液混勻,點入配制好的瓊脂糖凝膠樣品孔中,在1×TAE電泳緩沖液中加以5～10 V/cm的電場使DNA樣品向正極泳動30～60min.電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照像.

1.2.6 藥敏試驗 采用圓紙片法進行.取37℃培養(yǎng)18 h的致病性大腸桿菌,置于1mL滅菌生理鹽水中,充分混合后用移液槍吸取150μL,均勻涂布于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面.待瓊脂表面干燥后,用滅菌鑷子小心取已備好的各種藥敏紙片,每個藥敏紙片設3個重復.37℃恒溫培養(yǎng)24 h,測定抑菌圈直徑.判定標準[7]：抑菌圈直徑大于20mm為極度敏感,15.1～20mm為高度敏感,10.1～15mm為中度敏感,0～10mm為耐藥.

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病豬的臨床癥狀與病理變化

發(fā)病豬只精神高度沉郁,食欲廢絕,體溫達38～39℃,眼瞼紅腫,步態(tài)失調(diào),繼而臥地不起,四肢劃動呈游泳狀,呼吸快而淺,進而口吐白沫,叫聲嘶啞,后抽搐而死.剖檢病死豬,可見胃底黏膜彌漫性出血,胃大彎和賁門部水腫,切開水腫部,黏膜層和肌層之間有一層膠胨樣水腫液；心包、胸腔、腹腔有淡色積液,暴露空氣中5min后即凝結(jié)成膠胨樣；膀胱黏膜輕度充血.根據(jù)以上臨床癥狀和病理變化參照文獻[2]初步判斷為仔豬水腫病.

2.2 細菌的分離與培養(yǎng)結(jié)果

在16份疑似豬水腫病的病料中,10份病料中的細菌在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長出灰白色、圓形、稍隆起、光滑、濕潤、邊緣整齊的中等大小菌落（直徑約1～2mm）,在麥康凱培養(yǎng)基上長出磚紅色、圓形隆起、光滑、濕潤、邊緣整齊的菌落,在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上長出深黑色、圓整、濕潤、中等大小、具有黃綠色金屬光澤的菌落,在半固體培養(yǎng)基中可見穿刺線周圍的培養(yǎng)基有菌生長,呈倒三角形狀.將以上培養(yǎng)物進行常規(guī)涂片,革蘭染色后鏡檢,見到革蘭陰性、中等大小的桿菌.將培養(yǎng)特征和鏡檢特征比對文獻[8]中大腸桿菌的特征描述,認為分離到疑似大腸桿菌菌株10株.

2.3 細菌的生理生化鑒定結(jié)果

10株疑似大腸桿菌菌株的生理生化鑒定結(jié)果如表2所示.將10株疑似菌株的生理生化試驗結(jié)果與文獻[8]中大腸桿菌生理生化特性的描述進行比對,確定分離到的10株疑似大腸桿菌菌株均為大腸桿菌.

表2 細菌生理生化試驗結(jié)果

2.4 分離菌株的致病性試驗結(jié)果

試驗組小白鼠在2～3 d內(nèi)都出現(xiàn)了一些變化,精神沉郁,體溫升高,采食量大幅減少,7 d后全部死亡；而對照組全部正常存活,這說明接種菌株為致病性菌株.解剖死亡小白鼠,可見肝臟腫大、邊緣鈍圓,腸道彌漫性出血.采用麥康凱培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h,在平板上形成粉紅色或磚紅色,表面光滑,圓整,隆起,濕潤和中等大小的菌落.經(jīng)鏡檢和生理生化鑒定為大腸桿菌.這表明,所分離到的10株大腸桿菌均具有致病性.

2.5 菌落PCR結(jié)果

經(jīng)菌落PCR后,從10株菌株中均擴增出510 bp大小的條帶（見圖1）,說明這10株大腸桿菌為致仔豬水腫病的病原.

圖1 FedA亞基PCR擴增產(chǎn)物電泳

2.6 分離菌株的耐藥性分析

10株致病性大腸桿菌的藥敏試驗結(jié)果如表3所示.從表3中可以看出,就受試抗生素而言,所分離的10株大腸桿菌對青霉素和阿莫西林均耐藥,對慶大霉素、阿米卡星、沙拉殺星、洛美沙星和頭孢噻呋均沒有耐藥性.第 1、2、3、9 株為兩重耐藥,第 4、6、7、8、10 株為三重耐藥,第 5 株為四重耐藥.9 種抗生素中敏感性較高的是洛美沙星,極度敏感的有2株（2/10）,高度敏感的有8株（8/10）；其次是慶大霉素,極度敏感的有1株（1/10）,高度敏感的有7株（7/10）.

表3 藥敏試驗結(jié)果

3 小結(jié)與討論

該研究首先對疑似仔豬水腫病的病、死仔豬進行臨床癥狀和病理變化的觀察,再通過觀察分離菌株的形態(tài)、分離培養(yǎng)、生化反應、小白鼠感染試驗和PCR鑒定,最終確定引起該豬場仔豬發(fā)病的病原為豬水腫病大腸桿菌.通過細菌分離、生理生化試驗、小白鼠試驗后得到的結(jié)論是所分離菌株是致病性大腸桿菌,但卻不能確定是導致仔豬水腫病的病原.FedA是F18ab（F107ab）菌毛的主要結(jié)構(gòu)亞單位基因,而F18ab菌毛與仔豬水腫病有關[9],是致水腫病大腸桿菌的主要毒力因子之一[10].因此,若通過PCR擴增出FedA基因,則能表明所分離的大腸桿菌為導致仔豬水腫病的病原.本試驗正是通過這一原理證實了所分離的菌株為仔豬水腫病病原.

通過藥敏試驗篩選敏感藥物用于治療大腸桿菌病是目前常用的方法[2].藥敏試驗結(jié)果表明,從這幾個豬場分離到的菌株對不同的抗生素產(chǎn)生了耐藥性,有的還是多重耐藥,但是仍然有對所分離菌株都比較敏感的抗生素,如洛美沙星和慶大霉素.目前,動物源性大腸桿菌耐藥性呈現(xiàn)出以多重耐藥為主的趨勢[11].因此,中藥和其它抗生素替代品是未來用防治大腸桿菌病的希望.

[1]AlexaP,Hamrik J,StouracovaK,etal.Passiveimmunoprophylaxis of edemadiseaseinweaned piglets[J].VetMed,2004,49（12）：447-452.

[2]陳溥言.獸醫(yī)傳染病學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2006：111-119.

[3]易本馳,陳敏,何敏,等.信陽地區(qū)規(guī)?；i場大腸桿菌耐藥性監(jiān)測[J].中國獸醫(yī)雜志,2010,46（2）：25-26.

[4]楊明柳.致豬水腫病大腸桿菌二重PCR檢測方法及三價滅活菌苗研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文,2007.

[5]胡建和,王麗榮,杭柏林.動物微生物學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術出版社,2006：398-406.

[6]史麗華.仔豬致病性大腸桿菌的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志,2010,46（6）：53-54.

[7]朱模忠.獸藥手冊[M].北京：化學工業(yè)出版社,2002：42-43.

[8]陸承平.獸醫(yī)微生物學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2007：99-107.

[9]Imberechts H,De Greve H,Schlicker C,et al.Charactenzation of F107 fimbriae of Escherichia coli 107/86,which causes edema disease in pigs,and nucleotide sequence of the F107major fimbrialsubunitgene,fed A[J].Infect Immun,1992,60（5）：1963-1971.

[10]Smith HW,Halls S.The production of edema disease and diarrhoea in weaned pigs by the oral administration of Escherichia coli：factors thatinfluence the courseorexperimentaldisease[J].JMed Microbiol,1968（1）：45-59.

[11]夏倫斌,左瑞華,葛凱,等.規(guī)模化豬場致病性大腸桿菌的耐藥性分析[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,37（6）：183-185.