海藻酸鈉-殼聚糖微球制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

，， ，，

(1.吉林大學(xué)第四臨床醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130011；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117;3.吉林工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

微球是緩控釋新型給藥系統(tǒng)，根據(jù)不同的需要可以作為口服劑、注射劑等使用，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥研究和應(yīng)用的趨勢(shì)。制備的微球主要有白蛋白微球[1]、明膠微球[2]、聚乳酸微球[3]等，根據(jù)材料性質(zhì)的不同，可以采用溶劑揮發(fā)法[4]、噴霧干燥法[5]等進(jìn)行微球制備。但是有些材料和制備方法存在一定的弊端，如聚氰基丙烯酸酯等，在體內(nèi)不容易降解和代謝，在制備過(guò)程中多用有機(jī)溶劑，如固化劑甲醛、戊二醛等，殘留在制劑中不容易除去，且有些方法在制備過(guò)程中需要在高溫條件下進(jìn)行，對(duì)藥物穩(wěn)定性具有一定影響。本研究采用可生物降解的海藻酸鈉和殼聚糖為材料，制備過(guò)程不加有機(jī)試劑，并且反應(yīng)條件溫和。

葫蘆素(cucurbitacin，CU)系從葫蘆科植物甜瓜蒂(PedicellusMelo)提取分離而得，是治療肝炎和肝癌的有效成分,其中主要成分為葫蘆素B(CUB)[6]。為提高藥物的生物利用度、降低毒性作用，將其制備成微球制劑，達(dá)到緩釋的作用，本文以其主要藥用成分CU為指標(biāo)對(duì)其載藥量、包封率及體外釋藥進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司) ；Al204型電子天平 (梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ3200DB型速控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；SHA-CA水浴恒溫振蕩器 (江蘇金壇市精達(dá)儀器制造廠)；SZ-1渦旋混勻機(jī)(江蘇金壇江南儀器廠)；HJ-5多功能攪拌器(常州日華電器有限公司)。

1.2 試藥與試劑 葫蘆素B對(duì)照品(CUB)(純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.85%，購(gòu)自天津藥物研究院)，甜瓜蒂提取物(本實(shí)驗(yàn)室自制)，殼聚糖(中脫乙酰度75.0～89.0%，批號(hào)090303，購(gòu)自沈陽(yáng)鑫盛生物科技有限公司)，海藻酸鈉(黏度8mpa.s，批號(hào)090312，購(gòu)自青島晶巖生物科技開(kāi)發(fā)有限公司)，十二烷基硫酸鈉、氯化鈣、香草醛、乙酸、三氯甲烷、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、冰醋酸、高氯酸、硫酸均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 微球的制備 本研究采用滴制法制備海藻酸鈉-殼聚糖微球。將一定量藥物溶解于海藻酸鈉水溶液中，混合均勻，滴入含有一定量氯化鈣的殼聚糖溶液中，并攪拌一定時(shí)間取出，蒸餾水洗滌數(shù)次，室溫干燥，即得。

2.2 載藥微球的評(píng)價(jià)

2.2.1 微球形態(tài)學(xué)特征 干燥前的微球?yàn)榘咨膶?shí)體球，表面光滑，具有一定的硬度，正圓形，見(jiàn)圖1。干燥后的微球略顯黃色，顯微鏡下觀察表面有眾多皺紋，微球縮水皺縮所致，見(jiàn)圖2。

2.2.2 微球粒徑及分布 按照微球制備方法制備三批微球，采用顯微鏡測(cè)定微球的粒徑大小。隨機(jī)取制備的微球適量，測(cè)定每個(gè)球體三個(gè)角度的直徑，防止球體不圓整測(cè)量不準(zhǔn)，計(jì)算微球的平均粒徑和粒徑分布狀況。結(jié)果制備3批微球的平均粒徑為342.8 μm，337.6 μm，322.5 μm，平均粒徑為(334.3±10.54)μm，表明微球粒徑大小較均一，粒徑分布較窄，分散性好。

圖1 微球圖片

圖2 微球顯微圖片(×4)

2.2.3 微球的圓整度 在3批微球樣品中，每批微球取出100粒，采用“2.2.2微球粒徑及分布”項(xiàng)下方法測(cè)定每1微球3個(gè)不同角度的粒徑，計(jì)算RSD值。根據(jù)微球粒徑的RSD值為微球打分，具體打分標(biāo)準(zhǔn)如下：RSD值=0～2%，圓整度很好，10分；RSD值=2%～4%，圓整度良好，8分；RSD值=4%～6%，圓整度較好，6分；RSD值=6%～8%，圓整度一般，4分；RSD值=8%～10%，圓整度稍差，2分；RSD值>10%，圓整度不好，0分。經(jīng)測(cè)定，微球粒徑的RSD值為3.15%,微球的圓整度良好。

2.2.4 CU含量測(cè)定方法學(xué)研究

2.2.4.1 CU對(duì)照品、供試品溶液的制備 對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取CUB對(duì)照品10 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制備成1.0 mg/mL的CUB對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：分別精密稱(chēng)取載藥微球制劑及空白微球各25 mg,加1 mL蒸餾水浸泡30 min，研磨至均勻膠漿，加入2 mL三氯甲烷，漩渦10 min后，3 800 r/min離心10 min,取三氯甲烷層。再次加入三氯甲烷，同上處理，反復(fù)3次，合并三氯甲烷層，備用。

2.2.4.2 CU檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 稱(chēng)取CU成分，采用香草醛-冰醋酸法顯色，紫外分光光度計(jì)400～700 nm波長(zhǎng)范圍掃描。CU在532 nm處有最大吸收峰，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為532 nm。

2.2.4.3 CU線(xiàn)性關(guān)系的確定 精密吸取CUB對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于容量瓶中，配成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL溶液，采用香草醛冰醋酸反應(yīng)顯色在532 nm處檢測(cè)。以吸光度值(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到回歸方程：Y=0.783 4X+0.031 8(R=0.999 2)，結(jié)果表明，CU的檢測(cè)濃度在0.1～0.6 mg/mL呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.4.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取CUB對(duì)照品溶液0.3 mg/mL，香草醛-冰醋酸反應(yīng)顯色后，在532 nm處連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算精密度。結(jié)果其RSD為0.58%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取CU供試品溶液，香草醛-冰醋酸反應(yīng)顯色后，532 nm處測(cè)定，測(cè)定時(shí)間分別為10、20、30、45 min，1、2、3、4 h。結(jié)果顯示，CU在4 h內(nèi)測(cè)試穩(wěn)定，RSD值為1.47%。

2.2.4.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 制備CU供試品溶液5分，精密吸取1 mL，香草醛-冰醋酸反應(yīng)顯色后，在532 nm處測(cè)定，計(jì)算RSD值。結(jié)果表明供試品溶液重現(xiàn)性RSD=2.07%，樣品重現(xiàn)性良好。

2.2.4.7 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取15 mg的微球制劑，分別加入1∶0.8、1∶1、1∶1.2 3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照供試品處理方法制備，在532 nm處測(cè)定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求其含量。根據(jù)各樣品的加入量，計(jì)算其回收率。結(jié)果表明，高、中、低3種濃度的回收率分別為96.05%，95.83%，95.94%，RSD值為0.46%，0.52%，0.60%，表明供試品測(cè)試的制備方法可行。

2.2.4.8 微球中藥物的含量測(cè)定 精密吸取3批樣品的供試品溶液，60 ℃水浴揮干，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，再加入0.8 mL高氯酸，水浴60 ℃反應(yīng)15 min，冷卻至室溫，加入冰醋酸5 mL，532 nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算含量。空白為空白微球在供試品相同條件下的反應(yīng)溶液。微球中CU的含量為20.48 mg/g。

2.2.5 載藥量及包封率測(cè)定 測(cè)定微球中皂苷的含量，按照公式：載藥量%=(微球中藥物的重量/微球重量)×100%，包封率%=(微球中藥物的重量/投入的總藥量)×100%計(jì)算載藥量及包封率。結(jié)果微球的包封率為78.72%，載藥量為17.50%。

2.3 微球體外釋藥研究 分別精密稱(chēng)取微球制劑及空白微球各0.5 g置透析袋中，以50 mL pH 7.2的磷酸鹽緩沖液(含5%的十二烷基硫酸鈉)為釋放介質(zhì)，置于水浴恒溫振蕩器中，控制溫度在(37±0.5) ℃，攪拌速度為50 r/min，于不同時(shí)間30 min，1、2、4、6、8、10、22、26、30、34、46、52、60 h)取樣5 mL，同時(shí)補(bǔ)充同體積同溫度的釋放介質(zhì)5 mL。透析樣品按照供試品溶液的制備方法處理，采用香草醛冰醋酸反應(yīng)檢測(cè)透析液中的CU的含量。以取樣時(shí)間(t)為橫坐標(biāo),累積釋放百分率(%)為縱坐標(biāo)繪制釋放曲線(xiàn)。對(duì)釋放曲線(xiàn)進(jìn)行零級(jí)，一級(jí)，Higuchi方程擬合，由擬合方程得知，CU的釋放曲線(xiàn)符合Higuchi方程，制備的微球均具有緩釋作用。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 微球體外釋放擬合方程及相關(guān)系數(shù)

圖3 微球體外釋藥曲線(xiàn)圖

3 結(jié)果與討論

3.1 微球的制備方法有很多，一般較為復(fù)雜，且多有有機(jī)溶劑參與，有的需要在高溫條件下進(jìn)行制備，對(duì)藥物微球的穩(wěn)定性及使用的安全性具有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)制備微球的輔料海藻酸鈉和殼聚糖均為可生物降解的無(wú)毒性材料，其生物相容性好，制備工藝簡(jiǎn)單，無(wú)有機(jī)試劑參與，安全可靠。

3.2 本研究制備的微球粒徑為(334.3±10.54)μm，大小均一，分布較窄，圓整度良好，干燥后的微球表面不光滑，具有一定的紋理，主要是微球縮水形成的，微球吸水后膨脹，紋理會(huì)漸漸舒展開(kāi)， 形成表面光滑的球體。

3.3 制備的微球體外釋藥考察結(jié)果表明，30 min時(shí)，微球中藥物釋放量均小于20%，避免了藥物的突釋現(xiàn)象。通過(guò)零級(jí)(R=0.919 5)、一級(jí)(R=0.964 8)、Higuchi(R=0.981 3)方程擬合可見(jiàn)，皂苷的釋放符合Higuchi方程，微球具有緩釋作用。分析原因，海藻酸鈉與殼聚糖在水中形成黏稠狀物質(zhì)，包裹在微球的表面，阻礙藥物溶出，同時(shí)水性凝膠本身也會(huì)阻礙藥物的溶出，達(dá)到長(zhǎng)效給藥的目的。藥物在釋放過(guò)程中，首先是微球吸收釋放介質(zhì)膨脹，釋放介質(zhì)滲入微球內(nèi)部，將內(nèi)部的藥物溶解到介質(zhì)里，主要依靠藥物的擴(kuò)散作用。另外，溶液的穿透力導(dǎo)致微球的外殼逐步降解或崩解，使內(nèi)部藥物溶出。所以，釋放過(guò)程由擴(kuò)散過(guò)程與降解過(guò)程共同控制。

本實(shí)驗(yàn)研究的微球制備方法簡(jiǎn)便可行，微球?qū)儆诰忈屩苿?，因此海藻酸鈉-殼聚糖微球作為藥物的緩釋載體，具有一定的應(yīng)用前景。

[1]鄒東娜,張典瑞,張學(xué)順,等.苦參堿白蛋白微球的制備及性質(zhì)[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,2006(12):824-827.

[2]劉琳娜,李欣,梅其炳,等.尼莫地平明膠微球的制備及其性質(zhì)研究[J].華西藥學(xué)雜志,2006(3):243-245.

[3]汪自然,徐啟勇,葉燕青.復(fù)乳法制備聚乳酸及其共聚物微球參數(shù)的研究進(jìn)展[J].國(guó)際生物醫(yī)學(xué)工程雜志,2006(4):238-242.

[4]李巖,孫殿甲,畢殿洲.聚乳酸、聚乳酸乙醇酸共聚物微球的制備及體外釋放影響因素研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2002(4):281-284.

[5]盛江峰,馬淳安,張誠(chéng),等.噴霧干燥法制備偏鎢酸銨微球時(shí)的形貌與粒度[J].高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào),2008(1):122-127.

[6]金巖,楊君.葫蘆素脂質(zhì)體的制備及包封率測(cè)定[J].山西醫(yī)藥雜志,2008(8):721-722.