高效液相色譜法測(cè)定小鼠血漿中黃芩苷含量及其藥代動(dòng)力學(xué)研究

王 麗，周慧芳，張艷軍，莊鵬偉

(天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

黃芩苷為黃酮類化合物，是唇形科植物黃芩的主要有效成分之一，其含量較多，屬葡萄糖醛酸苷化合物，并具有廣泛的藥理作用,如抗炎、抗病毒、保肝和解熱等[1]。近些年，通過大量的實(shí)驗(yàn)證明，黃芩苷還具有抗實(shí)驗(yàn)性心律失常、抗腫瘤、抗氧化作用和對(duì)鈣離子的作用等。黃芩苷在臨床上應(yīng)用廣泛，現(xiàn)已被研制出多種劑型。研究黃芩苷在體內(nèi)代謝過程對(duì)其藥效機(jī)理和臨床用藥具有重要的指導(dǎo)作用。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用高效液相色譜法，測(cè)定黃芩苷在小鼠血漿的濃度變化規(guī)律并進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)分析[2-4]。

1 材料

1.1 對(duì)照品 黃芩苷對(duì)照品，中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào)07159708。

1.2 試劑 甲醇(色譜純，天津市協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司)；乙腈(色譜純，天津市協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司)；磷酸(分析純，天津市化學(xué)試劑三廠)；色譜分析用水(娃哈哈飲用純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；肝素鈉注射液(天津市生物化學(xué)制藥廠，批號(hào)H12020505)；乙醚(天津化學(xué)試劑廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量(25±2)g,天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供。

1.4 儀器 SOFTA6000高效液相色譜系統(tǒng);KQ-100A型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。XW-80A微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠);XS204分析天平(METTLER TOLEDO)。

2 方法學(xué)考察

2.1 色譜條件 C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(含0.05%的磷酸)(75∶25, V/V)，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的配制 用甲醇配制濃度為100 μg/mL的黃芩苷對(duì)照品溶液。

2.3 血漿樣品預(yù)處理 取小鼠血1 mL至肝素鈉試管中,離心后得空白血漿。取空白血漿100 μL，加入400 μL甲醇，于微型旋渦混合儀混合30 s，10 000 r/min離心，取上清液，氮?dú)獯蹈?，加?00 μL甲醇渦旋混合，取20 μL進(jìn)樣。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備、最低檢測(cè)限與定量限考察 取黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,配制成黃芩苷25、5、1、0.25、0.1、0.05、0.025 μg/mL的系列溶液,分別進(jìn)行測(cè)定。以峰面積(Y)對(duì)濃度(X)作線性回歸，得線性范圍和回歸方程，見表1，圖1。

圖1 黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

取對(duì)照品溶液,以流動(dòng)相稀釋,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以信噪比等于10計(jì)算,黃芩苷的最低定量限為0.036 87 μg/mL。

表1 黃芩苷線性關(guān)系

2.5 精密度試驗(yàn) 配制黃芩苷低、中、高3個(gè)濃度的對(duì)照品樣品混合溶液，按“血漿樣品預(yù)處理方法”處理樣品，分別進(jìn)行測(cè)定。同一濃度每隔1 h測(cè)定1次，測(cè)5次,計(jì)算日內(nèi)精密度；每隔1 d測(cè)定1次，測(cè)5 d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果見表2。

表2 血漿樣品中的精密度

試驗(yàn)結(jié)果表明,黃芩苷的低、中、高3種濃度在血漿中的日內(nèi)、日間精密度均符合要求。

2.6 回收率試驗(yàn) 配制黃芩苷低、中、高3個(gè)濃度的對(duì)照品混合溶液，按“血漿樣品預(yù)處理方法”處理樣品，分別進(jìn)行測(cè)定。按照對(duì)照品測(cè)得量和加入量之比計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

表3 血漿樣品中的回收率

試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩苷的低、中、高3種濃度在血漿中的回收率符合要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液，45 ℃以下氮?dú)獯蹈?，加?00 μL空白血漿，配制成血漿樣品中含黃芩苷1 μg/mL的溶液，按“血漿樣品預(yù)處理方法”處理樣品，將所配藥液于冰箱中冷藏，分別在0、1、2、4、6、8 h進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品測(cè)得量計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見表4。

表4 血漿樣品中的穩(wěn)定性

試驗(yàn)結(jié)果表明,黃芩苷的低、中、高3種濃度在血漿及腦組織中8 h的穩(wěn)定性符合要求。

圖2 黃芩苷對(duì)照品色譜圖

圖3 空白血樣色譜圖

圖4 加藥后血樣色譜圖

2.8 專屬性試驗(yàn) 在1.2.1項(xiàng)下的色譜條件下, 測(cè)定黃芩苷對(duì)照品、空白血樣及加藥后血樣，見圖2～圖4。

由圖可知黃芩苷的保留時(shí)間約為6 min,空白腦組織中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾黃芩苷在腦組織中濃度的分析。

3 樣品的測(cè)定及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算

3.1 黃芩苷在正常小鼠血漿中濃度的測(cè)定 健康小鼠60只，隨機(jī)分組,每組設(shè)置10個(gè)取樣點(diǎn)，每個(gè)取樣點(diǎn)6只小鼠。正常小鼠給藥前禁食不禁水12 h，按25 mg/1 000 g的劑量尾靜脈給予黃芩苷，分別于給藥后的5、15、30、60、90、120、180、240、360、480 min[5]采血0.5 mL左右，離心，取血漿。打開小鼠胸腔，用生理鹽水從左心室灌注，取腦組織(每一時(shí)間點(diǎn)取一只小鼠)。稱重后置玻璃勻漿器中勻漿。按“血漿及腦組織樣品預(yù)處理方法”處理樣品，進(jìn)行測(cè)定。以峰面積計(jì)算黃芩苷在正常小鼠血漿和腦組織中不同時(shí)間的藥物濃度數(shù)據(jù)見表5，其藥物濃度-時(shí)間曲線見圖5。

圖5 黃芩苷在正常小鼠血漿中的藥-時(shí)曲線

表5 黃芩苷在正常小鼠血漿及腦組織中的血藥濃度

3.2 黃芩苷在正常小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 采用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)數(shù)學(xué)藥理委員會(huì)編制的DAS1.0實(shí)用藥代動(dòng)力學(xué)軟件處理血藥濃度數(shù)據(jù),分別按一二三室模型進(jìn)行模擬，獲得AIC值和相關(guān)系數(shù)r。根據(jù)AIC值最小和r值最大原則，判定黃芩苷在正常型小鼠血漿中的藥-時(shí)過程均符合二室開放模型[6]。并求得其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表6。

4 討論

在優(yōu)化HPLC色譜條件時(shí)，本研究比較了乙腈、甲醇等溶劑與水按不同比例混合及磷酸的濃度配制成流動(dòng)相的分離效果,結(jié)果表明選用乙腈-水溶液(75∶25)含0.05%的磷酸[7]為流動(dòng)相可以很好地分離黃芩苷，且峰型較好、保留時(shí)間恰當(dāng),分離效果良好,血漿內(nèi)源性物質(zhì)及其他雜質(zhì)不干擾樣品的分離測(cè)定。

表6 黃芩苷在正常小鼠血漿主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(隔室模型,

H在優(yōu)化萃取條件的過程中，本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇、乙腈、高氯酸等溶劑的萃取效果，發(fā)現(xiàn)甲醇效果最好，黃芩苷峰形較好，且回收率較高，故選用甲醇對(duì)小鼠血清中的黃芩苷進(jìn)行萃取。

本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法測(cè)定小鼠血漿中黃芩苷含量的方法，實(shí)驗(yàn)證明，本方法能夠有效地測(cè)定藥物在血漿中含量的變化情況及其藥代動(dòng)力學(xué)研究，靈敏度高，重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)便快捷，對(duì)準(zhǔn)確考察黃芩苷對(duì)大鼠藥代動(dòng)力學(xué)的作用具有指導(dǎo)意義。

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