仙鶴草水提物急性毒性和遺傳毒性實(shí)驗(yàn)研究

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(1.海門(mén)市悅來(lái)醫(yī)院,江蘇 海門(mén) 226131；2.南通大學(xué)，江蘇 南通 226007)

仙鶴草為薔薇科多年生草本植物龍牙草(AgrimoniapilosaLedeb)的全草,又名脫力草、龍牙草、黃龍尾、狼牙草等，在我國(guó)大部分地區(qū)均有分布，全草含仙鶴草素、仙鶴草、內(nèi)酯、鞣質(zhì)、有機(jī)酸、酚性成分、皂甙等化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理研究[1]表明仙鶴草及其提取物具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、降血糖、降血壓、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用，臨床上主要用于止血、抗腫瘤，泌尿、呼吸、消化系統(tǒng)等疾病及婦科病的治療。但有關(guān)仙鶴草急性毒性和遺傳毒性的報(bào)道甚少。根據(jù)有關(guān)規(guī)定本研究對(duì)仙鶴草水提物進(jìn)行了急性毒性和微核實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)研究[2]。采用不同的實(shí)驗(yàn)指標(biāo),了解仙鶴草水提物的急性毒性及可能的中毒癥狀，測(cè)定其最大耐受量，為其在臨床上的安全應(yīng)用提供可靠的科學(xué)依據(jù)及安全性評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品 仙鶴草水提物：稱(chēng)取干燥仙鶴草(購(gòu)于中藥店)100 g,加入10倍體積的水，加熱提取2次,每次2 h，合并提取液，濃縮為80 mL，生藥含量1.25 g/mL。高速冷凍離心，用直徑為0.22 μm的微孔濾膜正壓過(guò)濾除菌。制備成1～2 g/mL水提液(水煮醇沉、過(guò)濾濃縮)備用。灌胃體積為0.4 mL/20 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年ICR小鼠,由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2006-0019。體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，禁食10 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)溫度(24±1)℃，相對(duì)濕度60%。實(shí)驗(yàn)前至少馴養(yǎng)觀察1周，記錄動(dòng)物的行為活動(dòng)、飲食、體質(zhì)量及精神狀況。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 1)注射用環(huán)磷酰胺(CY)：批號(hào)，900421，上海第十二制藥廠生產(chǎn)。2)小牛血清：濾菌后放入56 ℃恒溫水浴保溫1 h進(jìn)行滅活，4 ℃儲(chǔ)存。亦可用大、小鼠血清代替。3)Giemsa原液：稱(chēng)取Giemsa染料3.8 g，加入375 mL甲醇(分析純)研磨，待完全溶解后，加甘油125 mL，37 ℃恒溫箱保溫48 h，振搖數(shù)次，過(guò)濾，2周后可使用。4)磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)：KH2PO44.50 g，Na2HPO4·12H2O 11.81 g，蒸餾水至1 000 mL。

2 方法與結(jié)果

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)[3]預(yù)試驗(yàn)：小鼠30只，隨機(jī)分為3組，每組10只，以不同劑量的仙鶴草水提物灌胃，其中組1用量為20 g/kg；組2用量40 g/kg；組3用量80 g/kg。灌胃前動(dòng)物禁食過(guò)夜，自由飲水。灌胃后給予正常飲食，觀察中毒癥狀、死亡情況，觀察24 h,未見(jiàn)小鼠出現(xiàn)任何中毒反應(yīng)(觀察記錄的內(nèi)容包括皮膚、黏膜、毛色、眼睛、呼吸、循環(huán)、自主及中樞神經(jīng)系統(tǒng)行為表現(xiàn)等)。

最大耐受量測(cè)定：小鼠30只，以80 g/kg仙鶴草水提物灌胃，連續(xù)觀察7 d，未發(fā)現(xiàn)小鼠有任何中毒癥狀，在觀察期內(nèi)所有小鼠均存活。

結(jié)論：小鼠灌胃給予仙鶴草水提物浸膏的最大耐受量>80 g/kg。2周內(nèi)無(wú)動(dòng)物死亡，亦無(wú)明顯的中毒表現(xiàn)或不良反應(yīng)。即仙鶴草對(duì)雄、雌性ICR種小鼠的急性毒性LD50均>80 g/kg，屬無(wú)毒物。

2.2 微核試驗(yàn)[4]取體質(zhì)量18～20 g ICR小鼠50只，分為5個(gè)試驗(yàn)組,每組10只，雌雄各半。試驗(yàn)組分別為空白組生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組環(huán)磷酰胺，仙鶴草高劑量組80 g/kg,仙鶴草中劑量組40 g/kg，仙鶴草低劑量組20 g/kg。陽(yáng)性對(duì)照組用環(huán)磷酰胺生理鹽水溶液1次腹腔注射50 mg/kg。2次接毒，間隔24 h。

制片：在第2次給予受試物6 h時(shí)將小鼠脫頸椎處死。取下小鼠兩側(cè)股骨，剔去肌肉，用濾紙或紗布擦去血污和肌肉碎片，剪去兩端骨骺(小鼠股骨較短、細(xì)，剪股骨頭時(shí),應(yīng)盡量保持股骨中段的完整)后，用配有6號(hào)針頭的l mL注射器吸取小牛血清約0.05 mL，從股骨上端開(kāi)口處沖洗骨髓腔數(shù)次，將沖洗物從股骨下端開(kāi)口處滴到載玻片上。

推片：以同一注射器吸取載玻片上的沖洗物，然后推出，如此重復(fù)數(shù)次，使之調(diào)勻后，推片若干張迅速干燥。

固定：將干燥的涂片置甲醇液中固定5～10 min，取出晾干。

染色：固定好的涂片用Gimsa染色l5～30 min。用純化水沖洗,干燥，待檢。染液濃度、pH、染色時(shí)間等多種因素可影響染色效果，例如微核可被染成鮮紅色、藍(lán)紫色或紫紅色，甚至同一張標(biāo)本上也會(huì)出現(xiàn)染色深淺不一致的現(xiàn)象,因此計(jì)數(shù)前時(shí)必須仔細(xì)觀察PCE和成熟紅細(xì)胞的差別,正確辨認(rèn)。每只小白鼠計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞中具有微核的細(xì)胞數(shù)，微核率用‰表示。

先在低倍鏡下選擇細(xì)胞分散均勻、形態(tài)完整、染色良好的區(qū)域，再轉(zhuǎn)到油鏡下，觀察嗜多染紅細(xì)胞的微核。典型的微核多為單個(gè)、圓形、邊緣光滑整齊，偶爾呈腎形、馬蹄形或環(huán)形,嗜色性與主核一致，直徑通常為紅細(xì)胞的1/20～1/5。每張玻片標(biāo)本計(jì)數(shù)100～200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，按“‰”計(jì)算微核的出現(xiàn)率，微核計(jì)數(shù)以“細(xì)胞”為單位，即1個(gè)細(xì)胞中出現(xiàn)2個(gè)或2個(gè)以上微核時(shí)，只按“1”計(jì)算。

結(jié)果：各劑量組不同性別動(dòng)物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核細(xì)胞率與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表明受試物在最高劑量80 g/kg下，未見(jiàn)有誘發(fā)小鼠骨髓微核細(xì)胞率增高作用，見(jiàn)表1。

表1 仙鶴草對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率的影響

3 討論

仙鶴草首載于《本草圖經(jīng)》，主要功能在于收斂止血。近人李鐘文氏則認(rèn)為仙鶴草很多重要功能都已失傳，經(jīng)其從本草古圖譜、藥用部位、植物形態(tài)等多方面考證，認(rèn)為現(xiàn)在“處處有之”的仙鶴草，就是古人治療險(xiǎn)惡之癥的牙子。其名稱(chēng)演變過(guò)程為牙子一狼牙一狼牙草一龍牙草一龍芽草一仙鶴草[5]。在《神農(nóng)本草經(jīng)》中仙鶴草被歸于“多毒不可久服的下品藥，載：“牙子味苦寒，主邪氣熱氣，疥瘙惡瘍瘡痔，去白蟲(chóng)?！薄睹t(yī)別錄》稱(chēng)其有毒。李時(shí)珍亦從“有毒”之說(shuō)，將其置于毒草類(lèi)[6]。而現(xiàn)代藥理研究[7]也證明，仙鶴草的有效成分鶴草酚有毒，毒性主要表現(xiàn)在胃腸道及神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)，應(yīng)用較大劑量可使家犬雙目失明，病理觀察也證明了上述損害。文獻(xiàn)報(bào)道[8]過(guò)量服用仙鶴草致腎功能衰竭。此外臨床上仙鶴草不良反應(yīng)主要有失明、呼吸困難、皮疹、頭昏、面紅、惡心嘔吐、甚至引起過(guò)敏性休克。在大劑量應(yīng)用仙鶴草時(shí)應(yīng)權(quán)衡利弊,每劑高達(dá)500 g的劑量應(yīng)盡量避免。

仙鶴草是否無(wú)毒以及能否毫無(wú)顧忌地大劑量使用，事關(guān)臨床用藥的安全性。近年來(lái)，許多中藥毒理學(xué)研究表明，某些中草藥及其所含的某些化學(xué)成分具有特殊毒副作用，故對(duì)中草藥的毒理研究應(yīng)予高度重視。特別在遺傳毒性研究中，微核試驗(yàn)是目前國(guó)內(nèi)外廣泛用于檢測(cè)染色體損傷的一種快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的致突變篩選試驗(yàn)[9]。本文的目的就在于闡明仙鶴草水提物安全性，對(duì)仙鶴草進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：仙鶴草無(wú)明顯急性毒性反應(yīng)，無(wú)遺傳毒性，是一種安全無(wú)毒的中藥，可開(kāi)發(fā)成中藥新藥，挖掘其臨床應(yīng)用價(jià)值，為廣大患者造福。

[1]金在久.仙鶴草的化學(xué)成分及臨床研究進(jìn)展[J].華西藥學(xué)雜志,2006,21(5):468-471.

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政局.新藥(西藥)臨床研究指導(dǎo)原則匯編(藥學(xué)·藥理學(xué)·毒理學(xué))[M].北京:科學(xué)技術(shù)出版社,1993:203-204.

[3]李儀奎,王欽茂,陳奇,等.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1991:299-305.

[4]徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1985:508.

[5]宋·唐慎微.重修政和經(jīng)史證類(lèi)備用本草[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1957:258.

[6]明·李時(shí)珍.本草綱目(校點(diǎn)本)[M]北京:人民衛(wèi)生出版社,1982:11.

[7]范尚坦,李金蘭,左暉.仙鶴草的不良反應(yīng)[J].福建中醫(yī)藥,2002,33(1):47-48.

[8]賴(lài)中福,盧壬丹.過(guò)量服用木通、仙鶴草致腎功能衰竭各1例[J].中國(guó)藥業(yè),2003,12(7):59.

[9]中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:88.