過量鐵脅迫對豌豆幼苗光合特性和葉綠體膜的影響

藺冬梅，徐世健，張新芳，3，安黎哲，3，楊曉明，劉慧艷

(1.甘肅省莊浪縣農技推廣中心，甘肅 莊浪 744600；2.蘭州大學生命科學學院，甘肅 蘭州 730000；3.中國科學院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所，甘肅 蘭州 73000；4.甘肅省農業(yè)科學院，甘肅 蘭州 730070)

鐵是植物所必需的微量營養(yǎng)元素，在植物的生命活動(如光合作用、呼吸作用、氮代謝、DNA合成以及激素的合成)中起著重要作用。自20世紀初以來，植物鐵營養(yǎng)一直受到國內外植物營養(yǎng)學界的普遍關注，并在缺鐵原因、植物缺鐵脅迫的適應機理以及鐵的生理功能等方面的研究中取得了較大進展[1-2 ]。在熱帶和亞熱帶地區(qū)，具有較低氧化還原電位的酸性土壤中常會積累過量的亞鐵鹽，引起植物鐵毒癥[3-4]以及大豆(Glycinemax)、黃瓜(Cucumissativus)、亞麻(Linumspp.)等作物的生長不良現象都和Fe2+毒害有關[5]。研究表明，鐵毒致病的生理機理是植物體內積累過量的鐵以及鐵化合物誘發(fā)多種活性自由基，進而導致脂質過氧化和膜的損傷[3,6]。細胞內葉綠體膜是一個由極性脂質分子組成的雙分子層膜，具有正常功能的葉綠體膜處于流動的液晶態(tài)，膜的流動性保證了發(fā)生在膜上的光合作用得以正常進行。顯然，葉綠體膜組分及膜流動性的變化對于揭示異常環(huán)境對作物光合作用的影響及其機理具有重要作用。Jayawardena等[7]、Yamanauchi和Yoshida[8]認為，鐵毒的抗性機理主要在于葉片組織對鐵的耐性或抗性。目前國內外關于過量鐵對植物傷害和植物耐鐵毒機理方面的研究取得了較大進展[3,9]，而對過量鐵脅迫下光合特性和葉綠體膜組成及功能相聯系來探討植物對過量鐵脅迫的適應研究很少。為了探討過量鐵是通過氣孔因素還是非氣孔因素來抑制光合作用以及過量鐵是否會通過改變葉綠體膜組分和功能進而影響光系統(tǒng)的活性，研究了水培條件下過量鐵脅迫對豌豆幼苗光合特性和葉綠體膜組分及流動性的影響，為今后進一步研究鐵毒對光合作用的影響機理提供參考，同時也為探明過量鐵對植物的傷害機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與處理 豌豆(Pisumsativum)由甘肅省農科院提供。飽滿且胚完整的種子經70%酒精表面消毒5 min后，用蒸餾水反復沖洗，然后再經10% H2O2消毒10 min，用蒸餾水反復沖洗后，于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待種子露白后轉入1/2劑量的Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)，待第3片葉完全展開時，進行4個濃度水平鐵處理繼續(xù)培養(yǎng)：100(正常對照)、200、400和600 μmol/L。Fe2+以Fe(Ⅱ)-EDTA形態(tài)供應，每3 d換一次營養(yǎng)液，用KOH或HCl調pH值至6.0，溫度25 ℃，光照16 h，光照強度400 μmol/(m2·s)，相對濕度60%，電動氣泵連續(xù)通氣。處理7 d后測定各項指標。

1.2測定方法

1.2.1光合參數的測定 各處理均選擇長勢一致的植株，取第3葉位的功能葉進行測定，每個處理測定3株。用LI-6400光合測定儀測定凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)，并計算水分利用效率(WUE=Pn/Tr)，羧化速率(CE=Pn/Ci)。測定時大氣壓P為(100±0.1) kPa，CO2濃度為(380±10) μmol/mol，利用6400-O2LED紅藍光源控制光強PFD為800 mol/(m·s)，濕度為60%～70%，葉室溫度為25 ℃。

1.2.2葉綠素含量測定 葉綠素含量測定參考張志良[10]的方法，每個樣品重復3次。

1.2.3葉綠素熒光動力學測定 用PAM-2100葉綠素熒光分析儀測定初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、光化學猝滅系數(qP)、非光化學猝滅系數(qN)及光合電子傳遞速率(ETR)和光化學量子產量(Yield)，并計算最大光化學速率(Fv/Fm)、潛在光化學效率(Fv/Fo)。5次重復，測定前各葉片暗適應30 min，每次重復隨機選取3片葉子。

1.2.4葉綠體膜組分及流動性測定 葉綠體膜的提取及流動性的測定參考楊景宏和陳拓[11]的方法，膜脂肪酸測定參考Zhang等[12]方法略加修改?？傊崛∫院螅瑢⑻崛〉目傊?5%的NaOH/CH3OH溶液60 ℃水浴30 min進行皂化，待冷卻至室溫，加入酸化的CH3OH(6 mol/L HCl∶CH3OH，54∶46) 60 ℃水浴10 min進行甲酯化，并冷卻至室溫。用有機溶劑正己烷萃取后，將上相用堿性溶液(1.5% NaOH)進行純化。2 919 r/min室溫離心5 min，取上相蒸發(fā)濃縮后進行GC-MS分析。采用峰面積歸一化法計算各種脂肪酸甲酯的相對百分含量。

1.2.5數據分析 用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，利用Duncan多重比較法進行差異顯著性分析。所有數據為3次重復的平均值，數據以平均值±標準誤(mean±SE)來表示。

2 結果與分析

2.1過量鐵處理對光合指標的影響 隨著鐵濃度的升高，幼苗凈光合速率和蒸騰速率下降(圖 1A)。與對照相比，凈光合速率分別下降了17.16%、20.57%和45.30%；其中600 μmol/L鐵處理時光合速率下降最明顯，同時蒸騰速率也顯著下降(P<0.05)，分別下降了6.87%、12.70%和17.38%(圖1A)。此外，氣孔導度隨鐵濃度升高顯著下降(P<0.05)，分別下降了9.70%、47.98%和56.38%(圖1B)，結果表明葉片氣孔導度變化規(guī)律與凈光合速率的變化極其相似，這說明過量鐵處理下，凈光合速率的下降主要由氣孔因素造成；葉片胞間CO2濃度也隨著鐵濃度升高而顯著下降(P<0.05)，與對照相比分別下降了8.19%、9.69%和16.92%(圖1C)，說明過量鐵處理下氣孔抑制影響了葉片的氣體交換與CO2吸收，進而抑制了光合作用的進行；同時與對照相比，葉片水分利用效率和羧化速率隨著鐵濃度升高逐漸下降，幼苗水分利用效率分別下降了11.37%、6.03%和16.71%，羧化效率分別下降了9.81%、12.25%和17.65%(圖1D)。

2.2對葉綠素含量及光譜吸收的影響

2.2.1對葉綠素含量的影響 與對照相比，葉綠素a、葉綠素b、總色素含量以及類胡蘿卜素含量均呈現不同程度的下降趨勢。同時，對照組和處理組間各色素差異顯著(P<0.05)(圖2)。過量鐵處理下葉綠素含量的下降可能是葉片在遭受過量Fe脅迫時，植物細胞色素系統(tǒng)遭到破壞，導致葉綠素含量降低[13]，在葉綠體中積累了過量鐵，導致自由基大量產生并將其進行氧化，使葉綠素的含量逐漸減少。而色素含量的下降又直接造成光合作用的下降。同時從Fe2+濃度與葉綠素含量變化關系也可以看出，過量施Fe2+會明顯降低葉片葉綠素含量。此外，過量鐵脅迫導致類胡蘿卜素含量下降，而類胡蘿卜素尤其是β-胡蘿卜素能猝滅不穩(wěn)定的三線態(tài)葉綠素，具有強氧化作用，從而保護受光激發(fā)的葉綠素免遭光氧化的破壞，降低了單線態(tài)氧對光合膜的損傷。因此，類胡蘿卜素含量的降低可能使葉綠素遭破壞，也在一定程度上抑制了植物光合作用的正常進行。

圖1 過量鐵脅迫對豌豆幼苗光合參數的影響

圖2 過量鐵脅迫對豌豆幼苗葉綠素含量的影響

2.2.2對葉綠素吸收光譜的影響 豌豆幼苗在過量鐵處理后，葉綠素在可見光區(qū)仍然存在兩個強的吸收帶。紅光區(qū)的最強吸收帶在663 nm左右，藍光區(qū)的最強吸收帶在432 nm左右。葉綠素吸收光譜各曲線間相比較可以發(fā)現，除吸收峰的高低隨鐵濃度變化以外，各吸收曲線的形狀或變化趨勢基本一致，并沒有出現吸收波的偏移(圖 3)，這說明過量鐵只造成葉綠素含量的變化而對其分子結構并沒產生破壞作用。

2.3對葉綠素熒光動力學影響

2.3.1對初始熒光和最大熒光的影響 與對照相比，隨著鐵濃度的升高，Fo逐漸上升且顯著高于對照(P<0.05)，其增長率依次為42.04%、47.41%和48.30%(圖4A)，與Fo變化相反，Fm隨著鐵濃度升高逐漸下降，下降率依次為4.03%、4.24%和34.33%(圖4A)。從Fo變化規(guī)律圖可以看出，200 μmol/L是一個關鍵點，高于200 μmol/L時，Fo趨于穩(wěn)定，這表明PSRC反應中心受到了嚴重的破壞，受到了傷害或不可逆失活。此外PSⅡ(多亞基蛋白復合體)位于類囊體膜上，Fo的上升可能是過量鐵脅迫導致類囊體膜結構的破壞引起的。

圖3 過量鐵脅迫對豌豆幼苗葉綠素吸收光譜的影響

2.3.2對最大光化學速率和潛在光化學效率的影響 與對照相比，過量鐵導致Fv/Fm逐漸下降，其下降率依次為0.57%、1.03%和1.51%(圖4B)；與Fv/Fm變化相似，Fv/Fo隨鐵濃度升高而逐漸下降，其下降率依次為3.07%、4.13%和10.53%(圖4B)。上述結果表明，過量鐵脅迫時PSⅡ反應中心處于完全關閉時的量子產量下降，通過PSⅡ的電子傳遞量減少，對PSⅡ反應中心產生了損害，致使光能轉化能力顯著下降。

2.3.3對光合電子傳遞速率和光化學量子效率的影響 隨著鐵濃度升高，ETR與對照相比顯著下降(P<0.05)，其下降率依次為12.29%、14.93%和19.34%(圖4C)；與ETR相似，Yield也隨鐵濃度的升高呈下降趨勢，其下降率依次為9.78%、13.71%和16.92%(圖4C)。結果表明，過量鐵脅迫降低了PSⅡ的原初光能捕獲能力與光合電子傳遞能力，從而導致了光合系統(tǒng)功能的下降。

2.3.4對光化學猝滅系數和非光化學猝滅系數影響 與對照相比，過量鐵脅迫下qP顯著下降(P<0.05)，其下降率依次為6.04%、15.66%和25.65%(圖4D)；與qP相反，qN隨著鐵濃度的升高呈現上升趨勢，其增長率依次為0.31%、16.02%和17.56%(圖4D)。結果表明,過量鐵脅迫嚴重破壞了豌豆幼苗光合電子傳遞途徑，使得光合電子傳遞活性不斷下降，用于光化學反應的能量逐漸減少，而以熱能形式散失掉的光能部分逐漸上升。

2.4對葉綠體膜組分及流動性的影響

2.4.1對葉綠體膜組分的影響 表1是過量鐵脅迫下葉綠體膜脂肪酸組成的氣相色譜分析結果。豌豆葉片葉綠體膜脂肪酸主要由豆蔻酸(14∶0)、棕櫚酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)、亞油酸(18∶2)、亞麻酸(18∶3)組成，且以亞麻酸為主，含量超過60%。過量鐵脅迫使葉片膜脂肪酸組分并沒發(fā)生改變而使其配比發(fā)生了變化，各處理組飽和脂肪酸的相對含量都低于對照組，與此相對的是不飽和脂肪酸的含量則較對照組有所提高。與對照相比，隨著鐵濃度升高，棕櫚酸含量逐漸下降，分別降低了1.91%、3.71%和25.07%，相反亞油酸含量上升，增長率分別為15.99%、0.94%和16.28%(表1)。結果表明，過量鐵脅迫下葉片飽和脂肪酸含量逐漸下降，而不飽和脂肪酸含量上升，膜脂脂肪酸不飽和指數(IUFA )也上升。

圖4 過量鐵脅迫對豌豆幼苗葉綠素熒光特性的影響

表1 過量鐵脅迫下豌豆葉綠體膜脂脂肪酸組成

2.4.2對葉綠體膜流動性的影響 圖5為過量鐵脅迫處理后豌豆幼苗葉片葉綠體膜的ANS熒光掃描曲線圖。經過量鐵脅迫處理后的豌豆葉綠體膜的ANS熒光曲線峰值均低于對照組。以往的研究表明，與膜結合的ANS熒光強度的變化可以間接地反映膜脂流動性的變化，且熒光強度愈大，表明膜脂的流動性愈小[11]。過量鐵處理提高了幼苗葉綠體膜的流動性，這與表1揭示的過量鐵作用下豌豆葉綠體膜脂肪酸組分的變化是相對應的。因此，推測過量鐵脅迫下葉綠體膜流動性的變化可能是由鐵脅迫引起的膜不飽和脂肪酸升高所造成的。

圖5 過量鐵脅迫對豌豆幼苗葉綠體膜流動性的影響

3 討論

光合作用是高等植物生長發(fā)育和產量形成的基礎，目前過量鐵對植物光合作用的影響是鐵脅迫生物學效應研究的重點。眾所周知，逆境脅迫會導致植物凈光合速率的下降，一般認為凈光合速率的下降由兩種因素引起：氣孔因素和非氣孔因素[14]。本研究表明，隨著鐵濃度的升高，鐵脅迫引起葉片凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率均大幅度降低。此外，過量鐵脅迫下豌豆幼苗的蒸騰速率、氣孔導度迅速下降，葉肉細胞的水分利用效率以及羧化速率也呈現不同程度的降低，這與章藝和劉鵬[15]的研究結果一致。同時，研究發(fā)現豌豆幼苗雖然受到過量鐵的毒害,但植物體尚沒有完全失去其生理功能，光合作用機制沒有被完全破壞，且光合作用的降低主要是由過量鐵脅迫下光合作用發(fā)生了氣孔抑制引起。

過量鐵脅迫對光合作用的影響是多方面的，葉綠素熒光信號可反映逆境因子對光合作用的影響[16]。分析葉綠素熒光參數的變化有助于探明光合機構受影響的部位[17]。最大光化學速率常被用作表明環(huán)境脅迫程度的指標和探針，Fv/Fm降低表明PSⅡ潛在活性受損，植物受到了光抑制[18],而PSⅡ失活或被破壞則導致初始熒光的升高[19]。在本研究中，過量鐵脅迫使葉片最大光化學速率逐漸下降，表明PSⅡ已經受到鐵脅迫的損害。初始熒光變化反應植物逆境條件下受害程度，它的上升表明PSⅡ反應中心失活[20]。而在逆境環(huán)境下，PSⅡ反應中心失活將嚴重影響光化學連鎖反應[19]。同時過量鐵脅迫使原初光能轉化效率下降，造成豌豆PSⅡ活性中心受損，使光合電子傳遞受阻，量子產額下降，從而推動碳同化循環(huán)的ATP加ADPH比例的失調，CO2同化速率下降，進而影響了豌豆幼苗光合作用的正常進行。

葉綠體膜是光合作用的場所，因此，研究過量鐵脅迫對光合作用與葉綠體膜系統(tǒng)結構與功能的影響在揭示過量鐵生物學效應的機理研究中具有重要意義。當然，葉綠體膜在植物光合作用的光捕獲和電子傳輸反應中也起著重要作用[9]。Zhang等[12]和王萍等[21]研究發(fā)現，不飽和脂肪酸的增加就意味著膜流動性的升高，使膜脂產生物相變化，從凝膠相變?yōu)橐壕?，膜脂的脂肪酸鏈由有序排列變?yōu)闊o序。脂肪酸配比發(fā)生變化，這種變化將導致膜上生化反應發(fā)生變化，從而引起光合能量利用效率發(fā)生改變。本研究表明，過量鐵脅迫使葉綠體膜飽和脂肪酸含量下降，而不飽和脂肪酸含量相對升高，從而引起膜流動性升高，進而影響細胞膜的光合特性。另外，葉綠素作為膜上色素蛋白復合體的重要組成部分，過量鐵脅迫下葉綠素含量的降低必將影響色素蛋白復合體的功能，使葉片光合速率下降，影響植物的正常生長發(fā)育。

4 結語

光合作用是高等植物物質代謝和能量轉化的最初源泉，同時也是一個極其復雜的生理過程。植物的光合速率與植物葉片的自身因素如葉綠素含量、葉片厚度密切相關,又受光照強度、氣溫、空氣相對濕度、土壤水分含量等外界因素的影響。本研究認為，過量鐵脅迫可能通過降低光合色素含量、PSⅡ活性中心受損、破壞葉綠體膜的結構和功能等多種非氣孔因素影響植物的光合作用，也可能通過氣孔因素間接影響植物的光合作用。盡管對于鐵與植物葉片光合作用的關系已開展了一些研究，但過量鐵到底以何種方式影響光合作用在許多方面仍不是十分清楚。例如:1)鐵毒引起植物體內葉綠素含量下降的具體機制如何？2)過量鐵如何對氣孔進行調控？3)過量鐵是否通過影響礦質元素的吸收而間接抑制光合作用？因此,在今后的研究中應該進一步結合分子學以及生物化學的方法來研究鐵毒脅迫下植物光合作用的生理和分子機制，進一步闡明光合作用與各脅迫因子間的特異性關系。

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