氣道滴入加煙熏法建立慢性支氣管炎大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究

王 瑛

慢 性 阻 塞 性 肺 疾 病 （chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是臨床常見的呼吸道疾病，是一種具有氣流受限特征、可以預(yù)防和治療的疾病。目前居全球病死原因的第4位，是嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題。目前該病發(fā)病機(jī)制不十分明確，治療手段有限。因此對(duì)慢性支氣管炎機(jī)制的研究仍是國內(nèi)外學(xué)者備受關(guān)注的問題，而如何建立合理便捷的動(dòng)物模型是研究的關(guān)鍵所在，本實(shí)驗(yàn)通過改良煙熏及脂多糖氣道滴入法成功建立了符合人類發(fā)病機(jī)制的大鼠慢性支氣管炎模型。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 雄性二級(jí)Wistar大鼠18只，鼠齡8周，體重（180+20）g（解放軍總醫(yī)院動(dòng)物中心提供）。分為正常組、對(duì)照組（生理鹽水組）、慢性支氣管炎組（又：慢支模型組）各6只。

1.2 煙熏材料 哈德門香煙（焦油含量1.4 mg）。

1.3 試劑 脂多糖（LPS，Sigma公司）。

1.4 方法 正常組，正常飼養(yǎng)，不做任何干預(yù)。生理鹽水組：分別于第2、9、16、23天，將大鼠以3%戊巴比妥按45 mg/kg腹腔麻醉后，仰臥位固定于大鼠固定板，行頸部、胸部脫毛。做頸部正中切口，長約2～3 cm，分離頸前肌，暴露并固定氣管，以靜脈留置針替代氣管導(dǎo)管行氣管插管,向大鼠氣管內(nèi)注入無菌生理鹽水 200 μl，完畢后迅速將大鼠直立旋轉(zhuǎn)10～20 s，使生理鹽水均勻分布于肺部。慢支模型組，分別于第1、8、15、22天，向大鼠氣管內(nèi)緩慢注入LPS 200 μl（脂多糖10 mg/瓶，購自美國Sigma公司，用無菌注射用水制成水溶液，1 mg/ml），以防窒息。完畢后迅速將大鼠直立旋轉(zhuǎn)10～20 s，使LPS均勻分布于肺部。 第3～8、10～15、17～22、23～28天，每天在有機(jī)玻璃熏煙箱內(nèi)持續(xù)吸入新鮮的哈德門香煙霧30 min，15支/次，2次/d。

1.5 標(biāo)本采集

1.5.1 肺泡灌洗[1]分離頸部氣管，在氣管下段做小“V”型切口，靜脈留置管為氣管套管，用預(yù)熱至37℃的生理鹽水，分次緩慢灌洗，5 m1/次，連續(xù)3次，回收率在82%～95%，收集灌洗液于15 ml離心管中，2000 r/min離心10 min，取上清液分裝，置-70℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 肺臟病理標(biāo)本制作[2]28 d后采集標(biāo)本之前，大鼠禁食、不禁水12 h，稱重。將大鼠腹腔麻醉后，迅速放血處死大鼠，開胸完整取出肺臟，向右肺注入10%甲醛磷酸鹽緩沖液5～7 ml，浸入10%甲醛液中固定。于右下肺矢狀面，右中葉冠狀面最大周徑處橫貫各取材1塊，常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下觀察各組肺組織病理形態(tài)學(xué)的改變。肺組織做病理學(xué)檢查。

1.6 氣道炎癥病變觀察及評(píng)分方法 根據(jù)文獻(xiàn)[3]小氣道病變?cè)u(píng)估方法和標(biāo)準(zhǔn)加以改進(jìn)。

2 結(jié) 果

2.1 一般表現(xiàn) 生理鹽水組大鼠反應(yīng)靈活，運(yùn)動(dòng)敏捷，呼吸規(guī)整，無咳嗽、氣喘，毛發(fā)整齊有光澤與正常組無異。慢支模型組大鼠熏煙4周后即出現(xiàn)咳嗽，活動(dòng)后出現(xiàn)氣喘、呼吸氣促，腹式呼吸明顯（嚴(yán)重者呼吸減慢或呼吸節(jié)律不整），反應(yīng)略遲鈍，不喜運(yùn)動(dòng)，扎堆，毛發(fā)零亂、無光澤。造模期間各組體重變化見表1，生理鹽水組體重?zé)o明顯變化，慢支模型組體重28 d后明顯減輕。

表1 三組大鼠造模期體重（g，±s）

表1 三組大鼠造模期體重（g，±s）

與生理鹽水組比較，*P＜0.05

分組 第1天 第10天 第20天 第28天生理鹽水組 216.15±12.05 276.15±19.85 358.70±28.97 404.86±24.65慢支模型組 211.33±11.90 259.00±17.68 302.00±25.24*337.65±27.13*

2.2 肺組織病理HE染色 生理鹽水組呼吸道及肺泡結(jié)構(gòu)正常，支氣管纖毛排列整齊，肺泡結(jié)構(gòu)完整，無肺氣腫及炎性細(xì)胞浸潤，支氣管壁平整，支氣管平滑肌無增厚、斷裂，氣管及支氣管管腔內(nèi)均無炎性滲出物。見圖1。

圖1 生理鹽水組病理染色表現(xiàn)

慢支模型組可見肺泡壁水腫明顯，氣道黏膜上皮纖毛部分粘連、倒伏、脫落，杯狀細(xì)胞增生，管壁炎細(xì)胞浸潤，支氣管平滑肌增厚，斷裂。見圖2。

圖2 慢支模型組病理改變

2.3 氣道炎癥病理評(píng)分 各組氣道炎癥評(píng)分見表2，與生理鹽水組比較，慢支模型組在各項(xiàng)評(píng)分均高，其中以氣道纖毛倒伏及炎細(xì)胞浸潤最為明顯，且氣道炎癥病理總分顯著增高（P<0.01），在浸潤的炎性細(xì)胞中又以淋巴細(xì)胞為主。

3 討 論

COPD是呼吸系統(tǒng)疾病中的常見病和多發(fā)病，其患病率和病死率均較高，是嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量和勞動(dòng)力的慢性疾病。因此，加強(qiáng)對(duì)COPD的防治，在降低患病率和病死率方面均具有重要的意義。COPD主要包括慢性支氣管炎和肺氣腫，診斷依照肺功能檢查，當(dāng)慢性支氣管炎和肺氣腫患者肺功能檢查出現(xiàn)氣流阻塞并且不完全可逆時(shí)，則診斷為COPD。因此，慢性支氣管炎和肺氣腫既可能是COPD的初級(jí)階段，又可能已經(jīng)屬于COPD。通過建立和研究動(dòng)物模型來模仿慢性支氣管炎的病理特征，為進(jìn)一步闡明COPD發(fā)病的遺傳背景、誘發(fā)因素、發(fā)病機(jī)制和藥物療效提供便利的條件。流行病學(xué)調(diào)查表明，吸煙是最重要的發(fā)病因素，大氣污染是輔助性因素[4]。香煙中含有4000多種自由基（free radical）和多種毒性成分，可損傷氣道上皮細(xì)胞，使支氣管黏液腺肥大，黏膜充血水腫、黏液過量分泌、聚集，也可通過誘導(dǎo)體內(nèi)發(fā)生氧化損傷和炎癥反應(yīng)而致慢性支氣管炎發(fā)生[5]。研究證實(shí)，在慢性支氣管炎形成之前，吸煙者氣道即出現(xiàn)了早期炎癥表現(xiàn)[6]，因此，針對(duì)這一早期過程的研究至關(guān)重要。但是，單純吸煙部分病例尚缺乏典型的氣道結(jié)構(gòu)重塑特征，因此不能完全代表慢性支氣管炎模型，并且單純吸煙模式造模時(shí)間長，煙霧量不易控制，所造成的慢支模型不穩(wěn)定，不易被復(fù)制。宋一平等[7]首次在國內(nèi)采用熏香煙和氣管內(nèi)間斷灌注脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的方法制作慢支動(dòng)物模型，結(jié)果顯示模型組大鼠氣管、支氣管和肺組織有典型的慢性支氣管炎和局限性肺氣腫的病理學(xué)改變，肺功能多項(xiàng)指標(biāo)顯著下降。李紅梅等[8]將單純熏香煙與熏香煙加氣道注入內(nèi)毒素兩種方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者均具有慢性支氣管炎的病理改變，但前者病變和表現(xiàn)都較輕，所需時(shí)間長（6～8周）分析其原因可能與前者氣道刺激強(qiáng)度不夠有關(guān)。LPS為革蘭陰性菌細(xì)胞壁的外膜結(jié)構(gòu)，也是重要的致炎因子，普遍存在于污染氣體及有機(jī)物灰塵中，長期吸入可直接引起氣道上皮損傷，激活各種炎性細(xì)胞，促使細(xì)胞因子的釋放，誘發(fā)氣道炎癥的出現(xiàn)，最終導(dǎo)致慢性支氣管炎的發(fā)生[9]。所以煙熏加LPS氣管內(nèi)滴注在發(fā)病機(jī)制及病理上均符合人類慢性支氣管炎的標(biāo)準(zhǔn)，是目前較為成功也是較為成熟的模型。本實(shí)驗(yàn)參考宋一平等熏香煙加氣管內(nèi)灌注內(nèi)毒素的方法加以改良復(fù)制了大鼠慢性支氣管炎的模型，既考慮到人類慢性支氣管炎的發(fā)病機(jī)制，又注意足夠的刺激強(qiáng)度，成功復(fù)制出了慢性支氣管炎的模型。

表2 各組氣道炎癥病理評(píng)分（±s）

表2 各組氣道炎癥病理評(píng)分（±s）

與生理鹽水組比較，*P<0.05，#P<0.01

生理鹽水組 慢支模型組鼠數(shù) 99氣道纖毛倒伏粘連缺失 1.29±0.23 45±12.23#上皮細(xì)胞變性壞死糜爛脫落 1.03±0.65 23±6.13#氣道上皮黏液杯狀細(xì)胞增生 0 13.2±1.08#氣道上皮鱗狀化生 0 7.25±1.71#氣道管壁黏膜充血水腫 1.37±1.18 1.75±0.5氣道管壁淋巴細(xì)胞浸潤 16.54±10.12 76.23±11.98#氣道管壁巨噬細(xì)胞浸潤 0.88±0.75 20.65±10.06*氣道管壁中性粒細(xì)胞浸潤 0.25±0.41 25.45±6.58*氣道平滑肌細(xì)胞斷裂/增生 0 16.58±11.64#病理積分 20.64±1.76 276.5±52.5#

本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物模型的臨床體征、病理特征均與人類慢性支氣管炎患者病情由輕到重發(fā)展過程中的改變相符合，本實(shí)驗(yàn)肺組織病理形態(tài)學(xué)特點(diǎn)表明所復(fù)制的大鼠模型符合人類慢性支氣管炎的特點(diǎn)，證明慢性支氣管炎大鼠模型復(fù)制成功，且方法簡單經(jīng)濟(jì)，適用于慢性支氣管炎的實(shí)驗(yàn)研究。

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