疏肝健脾飲對(duì)糖尿病性胃輕癱大鼠的干預(yù)作用

張 媛，蔡 侃，朱容容

糖尿病性胃輕癱（DGP）即糖尿病胃動(dòng)力障礙，又稱(chēng)糖尿病胃麻痹，是一組以胃排空延緩為特征的臨床癥狀群。以往由于診斷技術(shù)的落后，該病發(fā)病率較低，有報(bào)道此合并癥發(fā)病率為22%，另有報(bào)道為0.08%[1]，故未引起臨床醫(yī)師的重視。自從開(kāi)展核素胃排空測(cè)定后，近10年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)患病率多在50%左右[2]。由此可見(jiàn)，糖尿病性胃輕癱是糖尿病的常見(jiàn)合并癥，應(yīng)引起臨床醫(yī)師的注意?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)糖尿病性胃輕癱，主要是對(duì)癥治療，在控制血糖的基礎(chǔ)上，加用胃動(dòng)力藥物，有一定效果，但療效不理想。因此，尋求中醫(yī)藥治療該病的有效方法是擺在中醫(yī)藥工作者面前的艱巨任務(wù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠40只，200～220 g/只，山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥物 疏肝健脾飲（柴胡 9 g，白芍 15 g，枳實(shí) 9 g，黨參 12 g，黃芪 30 g，白術(shù) 9 g，清半夏 9 g，黃連 9 g，干姜 6 g，厚樸 9 g，木香 9 g，當(dāng)歸 12 g）由山東省中醫(yī)院中藥房提供，上藥煎煮30 min，2次過(guò)濾，濃縮為 2 g/ml。

1.1.3 試劑 鏈脲佐菌素及一氧化氮合酶免疫組化試劑盒：Sigma公司產(chǎn)品，北京博愛(ài)科貿(mào)有限責(zé)任公司；β2-腎上腺素能受體（β2-AR）試劑盒：北京北方偉業(yè)發(fā)展有限公司；5-羥色胺受體（5-HT4R）試劑盒 ：上海市史瑞可生物科技有限公司；胰島素、C肽放射免疫分析藥盒：北京東亞放免技術(shù)研究所。

1.1.4 儀器 羅氏血糖儀、試紙；AEL-160型電子天平：日本島津；EG1160石臘包埋機(jī)、RM2135石臘切片機(jī)、HI1220烤片機(jī)：德國(guó)LEICA公司；BX40生物顯微鏡、BHB生物攝影顯微鏡：日本奧林巴斯；Image-pro plus 5.1多媒體圖像分析儀：美國(guó)MediaCybemetics公司。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 大鼠購(gòu)回后穩(wěn)定飼養(yǎng)3 d。檢測(cè)尿糖陰性，無(wú)陽(yáng)性動(dòng)物。稱(chēng)重后隨機(jī)選出10只作為正常組，剩余30只禁食18 h后，2%鏈脲佐菌素（STZ）以50 mg/kg的劑量腹腔注射，正常組注射等體積生理鹽水，注射后24、72 h各測(cè)定大鼠非空腹尾靜脈血糖，將血糖持續(xù)>16.7 mmoL/L的大鼠隨機(jī)分為模型組15只、中藥組15只。各組大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料喂養(yǎng)，均隨意飲水。

1.2.2 給藥方法 模型組和中藥組在造模后開(kāi)始給予不規(guī)則飲食，僅單日給食雙日不給食，均自由飲水。4周后中藥組給予中藥灌胃，模型組給予等劑量生理鹽水灌胃，1次/d，給藥4周。給藥劑量相當(dāng)于成人臨床常用劑量的2倍[3]。稱(chēng)重1次/周，按新體重重新計(jì)算給藥量。

1.2.3 標(biāo)本采集及檢測(cè) ①一般項(xiàng)目：大鼠的皮毛、飲食、活動(dòng)、大小便情況；②每周測(cè)大鼠非空腹尾靜脈血糖及體重；③給藥8周后禁食24 h，測(cè)空腹血糖后，給予10%炭粉混懸液（其中活性炭和阿拉伯膠各占10%），按l ml/100 g灌胃，麻醉大鼠，30 min后打開(kāi)大鼠腹腔，用鑷子提取上端至幽門(mén)、下端至回盲部的腸管，置于托盤(pán)上，將小腸拉成直線，測(cè)量炭粉前端至幽門(mén)括約肌距離及幽門(mén)括約肌至小腸末端距離，計(jì)算胃腸推進(jìn)指標(biāo) [胃腸推進(jìn)指標(biāo)=炭粉前端至幽門(mén)括約肌距離 （cm）/幽門(mén)括約肌至小腸末端距離（cm）×100%]；心臟取血 6 ml，4 ℃自然凝固，離心，取血清2 ml，-20℃冰箱保存；④取胃竇組織，4%多聚甲醛固定，測(cè)定nNOS、5-HTR、β2-AR等指標(biāo)；方法：脫水、石蠟包埋、切片，按免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟染色，檢測(cè)胃竇肌間神經(jīng)叢中免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元及胃黏膜平均灰度值和積分光密度：用Image-pro plus多媒體圖像分析儀， 以像素點(diǎn) 0.389 μm 長(zhǎng)，4.306 μm×104 μm 測(cè)量窗下每張隨機(jī)選取400倍鏡下5個(gè)視野作圖像分析，以5個(gè)視野的均值作為該樣本的測(cè)量值；神經(jīng)免疫組化染色以細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色著色者為陽(yáng)性。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 正常組大鼠毛發(fā)光滑、好動(dòng)機(jī)警、二便正常；模型組和中藥組在造模2 d后出現(xiàn)多飲、多食、多尿、糞質(zhì)變稀，1周后皮毛凌亂無(wú)光、精神萎靡、活動(dòng)遲緩、大便量少，體重比正常組明顯減輕，并逐漸出現(xiàn)死亡。給藥終止時(shí)正常組10只、中藥組12只、模型組10只。

2.2 血糖動(dòng)態(tài)變化 造模前各組大鼠血糖無(wú)顯著性差異（P＞0.05），造模8周后，正常組大鼠血糖與模型組、中藥組大鼠相比有非常顯著性差異（P<0.01），造模8周后血糖與造模7 d后比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，表 1）。

表1 各組大鼠血糖水平（mmol/L）

2.3 胃腸推進(jìn)指標(biāo)比較 中藥組、模型組大鼠的胃腸推進(jìn)指標(biāo)均低于正常組（P<0.01）。中藥組大鼠的胃腸推進(jìn)指標(biāo)明顯高于模型組（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠的胃腸推進(jìn)指標(biāo)

2.4 免疫組化結(jié)果 nNOS：正常組與模型組比較P<0.01，正常組與中藥組比較P＞0.05，中藥組與模型組比P<0.01；5-HT4R：正常組與模型組比P<0.01，正常組與中藥組比P＞0.05。中藥組與模型組比P<0.05。 β2-AR：各組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠的免疫組化結(jié)果（μmol/L）

2.5 各組大鼠血清胰島素和C肽水平 中藥組和模型組的血清胰島素明顯低于正常組 （P<0.05），C肽明顯高于正常組（P<0.05）；中藥組大鼠的血清胰島素高于模型組 （P<0.05），C肽水平明顯低于模型組（P<0.05）。 見(jiàn)表 4。

3 討 論

造模3 d后，正常組大鼠血糖與造模后大鼠相比，均有非常顯著性差異（P<0.01）；7 d后造模大鼠血糖稍有下降但與8 d后血糖值無(wú)顯著性差異，說(shuō)明造模1周后糖尿病大鼠的高血糖狀態(tài)已經(jīng)造成并趨于穩(wěn)定。

表4 各組大鼠血清胰島素和C肽水平

腸肌間神經(jīng)叢nNOS陽(yáng)性神經(jīng)的顯著改變是糖尿病性胃輕癱較易出現(xiàn)的病理變化，通常作為糖尿病胃神經(jīng)病變的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒MnNOS顯著低于正常組（P<0.01）；并且模型組大鼠胃排空率顯著低于正常組（P<0.01）。表明本實(shí)驗(yàn)觀察的糖尿病大鼠存在神經(jīng)病變，可作為糖尿病性胃輕癱模型進(jìn)行研究。NO可引起胃腸道平滑肌松弛并調(diào)節(jié)食管下括約肌活動(dòng)，在胃排空的腸壁機(jī)械感受器和化學(xué)感受器的反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[4]，nNOS為神經(jīng)元型一氧化氮合酶，參與正常生理活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組nNOS與正常組相比有顯著性差異。模型組nNOS表達(dá)明顯增高，證明nNOS參與了糖尿病性胃輕癱的致病過(guò)程。

研究顯示：8周后大鼠的胃腸推進(jìn)指標(biāo)，正常組明顯高于模型組，中藥組明顯高于模型組 （P<0.01）；說(shuō)明實(shí)驗(yàn)大鼠存在胃腸動(dòng)力障礙，同時(shí)說(shuō)明健脾疏肝飲可改善糖尿病性胃輕癱大鼠的胃腸功能，加速糖尿病性胃輕癱大鼠的胃排空。

胃腸道至少存在四種5-羥色胺受體，其中5-HT3R和5-HT4R與胃腸運(yùn)動(dòng)和分泌功能最為密切。5-HT4R是一種G蛋白偶聯(lián)受體，影響胃腸道動(dòng)力及內(nèi)臟感覺(jué)[5]。胃腸功能紊亂時(shí)，存在一定程度的5-HT4R的代謝紊亂。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5-HT4R在正常組和中藥組中強(qiáng)表達(dá)，與模型組有非常顯著性差異（P<0.01），表明5-HT4R的減少可能與糖尿病性胃輕癱的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，表明健脾疏肝飲在干預(yù)糖尿病性胃輕癱大鼠模型的試驗(yàn)中有顯著作用。

有研究顯示糖尿病大鼠胃腸功能紊亂時(shí)β2-腎上腺素能受體減少[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果未證實(shí)其相關(guān)性意義。

糖尿病性胃輕癱病機(jī)為脾氣虛弱、運(yùn)化無(wú)力，中焦氣機(jī)不行逆于上，此其一。其二，肝主疏泄，氣機(jī)不暢責(zé)之于肝；且土氣不足，肝木逆乘脾土，脾氣受傷，則食難停化，胃失和降，氣逆于上而發(fā)生該病。筆者認(rèn)為，糖尿病性胃輕癱，病位在胃，病變臟腑除脾胃外，尚與肝脾有關(guān)。健脾疏肝飲取逍遙散、柴胡疏肝散、枳實(shí)消痞丸、枳術(shù)丸、半夏瀉心湯、四君子湯之意，組合加減而成。全方補(bǔ)瀉兼施、辛開(kāi)苦降、寒溫并用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證明健脾疏肝飲具有降糖和促進(jìn)胃排空的功效，且干預(yù)糖尿病性胃輕癱大鼠療效顯著。

[1]Clark D，Nowak T.Diabetic gastroparesis[J].Postgrad Med,1994,95(2):195.

[2]Marzio Glscobbe A.Evaluation of ultrasonography in the study of liquid gastric emptying[J].Am J Gastroenterol,1989,84(5):496.

[3]孫瑞元.定量藥理學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1987.243.

[4]Oribata.Nitric oxide mediates mechno-and chemo-receptor activated intestinal feedback control of gastric emptying[J].Dig Dis Sci，1996，41(12)：1303.

[5]李天津，余保平.5-羥色胺3、4受體與胃腸運(yùn)動(dòng)及臨床意義[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)消化系疾病分冊(cè)，2004，24（6）：354-357.

[6]張亞萍，石德紅，張寬學(xué)，等.糖尿病大鼠胃腸功能紊亂時(shí)β2-腎上腺素能受體與5-羥色胺受體表達(dá)的變化[J].中華糖尿病雜志，2004，12（4）：297-299.