脂肪酶法制備生物柴油的研究現(xiàn)狀及展望

王昌梅，張無(wú)敵，陳玉保，尹 芳，徐 銳，劉士清

(云南師范大學(xué) 太陽(yáng)能研究所，云南 昆明 650092)

脂肪酶法制備生物柴油的研究現(xiàn)狀及展望

王昌梅，張無(wú)敵，陳玉保，尹 芳，徐 銳，劉士清

(云南師范大學(xué) 太陽(yáng)能研究所，云南 昆明 650092)

脂肪酶法制備生物柴油具有反應(yīng)條件溫和、醇用量小、甘油易回收和無(wú)廢物產(chǎn)生等特點(diǎn)。對(duì)用于制備生物柴油的脂肪酶類(lèi)型(動(dòng)物脂肪酶、植物脂肪酶及微生物脂肪酶)、用于脂肪酶法制備生物柴油的原料油脂類(lèi)型(植物油脂、動(dòng)物油脂、微藻油脂及廢棄油脂)以及脂肪酶法制備生物柴油的方式(游離脂肪酶催化法、固定化脂肪酶催化法、復(fù)合脂肪酶協(xié)同催化法)進(jìn)行了綜述;并提出了脂肪酶法制備生物柴油的研究與發(fā)展方向，如對(duì)酶制劑的研究、生物柴油原料的解決以及對(duì)脂肪酶的使用方式進(jìn)行改進(jìn)，為今后脂肪酶法制備生物柴油的研究提供思路。

脂肪酶;生物柴油;酶催化;酯交換

生物柴油與傳統(tǒng)的石化柴油相比具有很多優(yōu)點(diǎn)，發(fā)展生物柴油在我國(guó)具有巨大的潛力［1］。生物柴油主要是以動(dòng)、植物油為原料，通過(guò)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)制備成的長(zhǎng)鏈脂肪酸酯類(lèi)物質(zhì)(脂肪酸甲酯或乙酯)。目前生物柴油的制備方法主要有化學(xué)法和生物酶法。化學(xué)法生產(chǎn)工藝較成熟，是目前制備生物柴油常用的方法;但化學(xué)法存在能耗高、工藝復(fù)雜、醇消耗量大、污染環(huán)境等缺點(diǎn)。生物酶法制備生物柴油是利用脂肪酶的催化作用，實(shí)現(xiàn)油脂與短鏈脂肪醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，具有反應(yīng)條件溫和、醇用量少、產(chǎn)物易分離、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。脂肪酶法對(duì)原料要求低，游離脂肪酸完全可以被脂肪酶直接酯化，副產(chǎn)物甘油分離簡(jiǎn)單，降低了生產(chǎn)工藝要求和生產(chǎn)成本，因而脂肪酶法制備生物柴油被認(rèn)為是取代化學(xué)法生產(chǎn)生物柴油的綠色工藝［2］。但脂肪酶法合成生物柴油也存在一些缺點(diǎn)：目前使用的脂肪酶僅對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)有效，而對(duì)短鏈脂肪醇的轉(zhuǎn)化率低;短鏈脂肪醇對(duì)脂肪酶有一定的毒性，使脂肪酶的使用壽命縮短;副產(chǎn)物甘油和水不但抑制產(chǎn)物形成，而且甘油對(duì)脂肪酶有毒性，也影響脂肪酶的使用壽命［3］。

本文對(duì)脂肪酶法制備生物柴油的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，并提出了將來(lái)的研究方向。

1 脂肪酶法制備生物柴油研究現(xiàn)狀

脂肪酶全稱為甘油三酰水解酶，其基本功能是催化甘油酯水解為甘油和脂肪酸。脂肪酶最早應(yīng)用于油脂工業(yè)是催化油脂水解生產(chǎn)脂肪酸［4］。隨著非水相酶學(xué)研究的深入以及對(duì)脂肪酶催化過(guò)程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)在一定的反應(yīng)體系中，利用脂肪酶的催化作用，還可實(shí)現(xiàn)油脂與短鏈醇的酯交換反應(yīng)，用于制備生物柴油［5］。脂肪酶催化制備生物柴油的反應(yīng)機(jī)理通常認(rèn)為是多個(gè)順序水解和酯化過(guò)程，即在酶催化微水環(huán)境中，三甘酯先水解成二甘酯和脂肪酸，然后脂肪酸和短鏈醇酯化合成脂肪酸烷基酯;二甘酯繼續(xù)水解成單甘酯和脂肪酸，脂肪酸再與短鏈醇酯化合成脂肪酸烷基酯;依次進(jìn)行順序水解和酯化反應(yīng)，直到甘油酯完全水解為甘油，產(chǎn)生的脂肪酸完全酯化合成脂肪酸烷基酯。甘油酯與短鏈醇還可以直接進(jìn)行?；D(zhuǎn)移，因?yàn)榇甲鳛轷；荏w，除了參與和脂肪酸的酯化過(guò)程，同時(shí)有可能與水競(jìng)爭(zhēng)獲得甘油酯的?；?，即不經(jīng)水解步驟直接產(chǎn)生脂肪酸烷基酯和二甘酯。

1.1 用于制備生物柴油的脂肪酶

脂肪酶廣泛存在于動(dòng)物肝臟、植物種子和微生物中［5］。不同來(lái)源的脂肪酶具有不同的催化特點(diǎn)和催化活性。目前，用于催化制備生物柴油的脂肪酶主要有Novozym 435［6-7］、南極假絲酵母Candida antarctia［8-9］、Candida rugosa［10］、固定化假絲酵母Candida sp.99-125［11］、米根霉Rhizopus oryzae［12-13］、米 根 霉 IFO4697［14-15］、 華 根 霉 CCTCC M 201021［16］、葡枝根霉 YF6［17］、洋蔥假單胞菌Pseudomonas cepacia［18-21］、熒 光 假 單 胞 菌LipB52［22］;此外，還有豬胰脂肪酶［23-24］、Penicillium Expansum TS414［25］和Enterobacter agglomerans［26］。它們催化油脂轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)得到脂肪酸甲酯的收率一般為70% ～100%［27］。

1.2 用于脂肪酶法制備生物柴油的原料油脂

1.2.1 植物油脂

來(lái)源于植物的油脂是較好的制備生物柴油的原料。生產(chǎn)生物柴油原料的植物要具備生長(zhǎng)快、單產(chǎn)高、含油量高的條件。不飽和脂肪酸含量高的油脂可避免冬季氣溫下降而凝固，油酸含量高的油脂所制備的生物柴油具有良好的貯存穩(wěn)定性及燃燒特性［28］。大豆油、棕櫚油、棉籽油、葵花籽油、紅花籽油、菜籽油、花生油、蓖麻籽油皆可作為脂肪酶法制備生物柴油的原料。此外，一些木本植物油脂(如桐油、麻瘋樹(shù)籽油)，其中含有佛波酯而不可食用，但油酸含量較高，也是制備生物柴油較好的原料［12］。劉偉濤等［29］研究了固定化Lipozyme TLIM和Novozym 435脂肪酶催化毛棉籽油和乙酸甲酯制備生物柴油，生物柴油收率達(dá)到91.83%。李俊奎等［30］研究了以石油醚提取的小桐子毛油和甲醇為原料，利用固定化Candida sp.99-125脂肪酶催化合成生物柴油，最高收率可達(dá)93%;該脂肪酶連續(xù)使用14個(gè)批次，生物柴油收率仍可保持在70%以上。

1.2.2 動(dòng)物油脂

動(dòng)物油脂中飽和脂肪酸含量較高，是制備生物柴油的原料之一。但目前以動(dòng)物油脂為原料，采用脂肪酶法催化制備生物柴油的報(bào)道并不多。Lu等［31］以豬油為原料，在Candida sp.99-125脂肪酶催化下制備生物柴油，生物柴油收率達(dá)87.4%。Shimada等［32］以金槍魚(yú)油為原料，采用固定化Candida antarctica脂肪酶逐步醇解工藝，生物柴油收率達(dá)90%。俞凌云等［24］以混合豬油、菜籽油為原料，采用豬胰脂肪酶催化制備生物柴油，油脂轉(zhuǎn)化率偏低，只有36%。

1.2.3 微藻油脂

微藻油脂是制備生物柴油的另一原料來(lái)源。Li等［33］報(bào)道，利用Chlorella protothecoids微藻油脂，在固定化Candida sp.99-125脂肪酶催化下制備生物柴油，油脂轉(zhuǎn)化率達(dá)98%，且該微藻油脂中的油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)44%～48%(基于細(xì)胞干重)。借助基因工程和遺傳工程技術(shù)及光照培養(yǎng)技術(shù)，培養(yǎng)繁衍能力強(qiáng)、油脂含量高、生長(zhǎng)周期短的工程微藻，降低微藻生物柴油的生產(chǎn)成本，比用植物油脂生產(chǎn)生物柴油更具有商業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力。

1.2.4 廢棄油脂

餐飲業(yè)廢棄的食用油、地溝油以及植物油脂加工后的油腳可作為制備生物柴油的原料。雖然原料成本低，但這些原料中聚合物和游離脂肪酸含量高、黏度大，進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)前必須進(jìn)行預(yù)處理，如用硅酸鎂吸附除去游離脂肪酸等雜質(zhì)，否則易導(dǎo)致催化劑失活［34］。韓春陽(yáng)等［35］以餐飲廢油為原料，用固定化Novozym 435與TLIM脂肪酶催化制備生物柴油，脂肪酸甲酯收率達(dá)85.7%;該脂肪酶在連續(xù)反應(yīng)266 h后，催化活性基本沒(méi)有下降。蘇敏光等［36］利用中性脂肪酶催化泔水油與甲醇反應(yīng)制備生物柴油，生物柴油收率可達(dá)89.7%以上。

1.3 脂肪酶法制備生物柴油的方式

1.3.1 游離脂肪酶法制備生物柴油

游離脂肪酶通過(guò)催化雙相體系油水界面的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)制備生物柴油?；谟退缑婊罨?yīng)的特點(diǎn)，脂肪酶催化制備生物柴油的反應(yīng)速率較快，不受底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散限制，產(chǎn)物與副產(chǎn)物分離簡(jiǎn)單。Kaieda等［37］利用游離 Rhizopus oryzae脂肪酶催化大豆油和甲醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，水的存在(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%～30%)有利于反應(yīng)的進(jìn)行。他們還比較了 3種游離脂肪酶 Candida rugosa，Pseudomonas cepacia，Pseudomonas flurescenes在無(wú)溶劑體系中催化大豆油和甲醇轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的性能，發(fā)現(xiàn) Pseudomonas cepacia和 Pseudomonas fluorescenes脂肪酶對(duì)甲醇的穩(wěn)定性非常好，其中又以Pseudomonas cepacia脂肪酶的穩(wěn)定性最好，大豆油的轉(zhuǎn)化率最高。蘇敏光等［36］利用游離中性脂肪酶催化泔水油與甲醇反應(yīng)制備生物柴油，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)獲得最佳反應(yīng)條件：油與醇的摩爾比1∶3，油與酶的質(zhì)量比1∶1，溫度45℃，油與溶劑的質(zhì)量比1∶0.6。在此條件下反應(yīng)10 h，生物柴油收率可達(dá)89.7%以上。吳良彪［38］利用游離脂肪酶催化食用廢油與甲醇反應(yīng)制備生物柴油，得到最佳反應(yīng)條件：溫度50℃，脂肪酶催化劑用量為原料質(zhì)量的3%，甲醇與食用廢油的體積比為3∶1，共溶劑丁酮與甲醇的體積比為1∶6，pH=7，反應(yīng)時(shí)間4 h。在此條件下，生物柴油收率達(dá)78%，產(chǎn)品的各項(xiàng)指標(biāo)均與 0#石化柴油相接近。呂丹等［39］采用游離NS81006脂肪酶催化含酸油脂制備生物柴油，生物柴油收率達(dá) 90%，通過(guò)離心分離可有效實(shí)現(xiàn)NS81006脂肪酶的回收使用，連續(xù)回用5個(gè)批次，游離脂肪酶活性未出現(xiàn)明顯下降。

游離脂肪酶在反應(yīng)體系中分散不均勻且容易聚集結(jié)塊，不利于回收和重復(fù)利用;并且甲醇對(duì)脂肪酶具有失活效應(yīng)，限制了脂肪酶在工業(yè)規(guī)模生物柴油生產(chǎn)中的應(yīng)用。通過(guò)固定化技術(shù)和全細(xì)胞催化劑的采用、甲醇流加方式的改進(jìn)等手段，可改善脂肪酶的催化活性和穩(wěn)定性，從而降低生產(chǎn)成本，加快生物柴油工業(yè)化進(jìn)程。

1.3.2 固定化脂肪酶法制備生物柴油

酶是高效、專一性強(qiáng)的生物催化劑，但是自由酶在水溶液中很不穩(wěn)定，可溶性酶一般只能起一次催化作用。同時(shí)酶是蛋白質(zhì)，在高溫、高離子濃度、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等條件下及部分有機(jī)溶劑中均不穩(wěn)定，容易失活而降低其催化活性，這些不足大大限制了酶促反應(yīng)的廣泛應(yīng)用［40］。20世紀(jì)70年代出現(xiàn)的固定化酶技術(shù)克服了游離酶的不足。固定化細(xì)胞技術(shù)是指用物理或化學(xué)方法將游離細(xì)胞固定于限定的空間區(qū)域，并使固定后的細(xì)胞擁有良好的催化活性和重復(fù)使用性的一種方法［41］。近年來(lái)在生物柴油的制備研究中固定化酶有所應(yīng)用，有望成為一種新型、高效、無(wú)污染、低成本的生物柴油工業(yè)化生產(chǎn)方法［42-44］。

溶膠-凝膠法制備固定化脂肪酶工藝簡(jiǎn)單，固定化脂肪酶的力學(xué)性能穩(wěn)定、生物相容性好，已成為脂肪酶固定化的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。Noureddini等［19］利用以四甲氧基硅烷和異丁基三甲氧基硅烷為前體的溶膠-凝膠法固定Pseudomonas cepacia脂肪酶，并催化大豆油轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，脂肪酶的穩(wěn)定性和催化活性顯著提高，重復(fù)使用11次后，活性僅喪失5%。Yagiz等［45］以人工合成水滑石為載體固定化Lipozyme TLIM脂肪酶，考察了溫度、pH、粒徑、時(shí)間對(duì)固定化效率的影響，并用該固定化脂肪酶催化廢油脂的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，室溫(24℃)下反應(yīng)105 h后轉(zhuǎn)化率達(dá)92.8%，重復(fù)使用7次后，殘余酶活為36%。高陽(yáng)等［46］以非極性大孔樹(shù)脂 NKA為載體，用物理吸附法固定化Candida sp.99-125脂肪酶，該法簡(jiǎn)便易行，在低水含量的庚烷體系中進(jìn)行大豆油的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，單批轉(zhuǎn)化率為97.3%，連續(xù)反應(yīng)19個(gè)批次，轉(zhuǎn)化率為70.2%，殘余酶活為85.1%。張寶華等［47］以絲瓜絡(luò)為載體，對(duì)Pseudomonas fluorescens脂肪酶進(jìn)行固定化，并催化餐飲廢油制備生物柴油，在40℃、醇與油的摩爾比3∶1、水質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%、無(wú)溶劑條件下，脂肪酸甲酯收率最高達(dá)88.7%，重復(fù)使用10次后脂肪酸甲酯收率達(dá)85.5%，適合于工業(yè)化應(yīng)用。李治林等［48］以硅藻土、聚氨酯樹(shù)脂、氧化鋁和海藻酸鈉4種載體固定化米根霉細(xì)胞，其中聚氨酯樹(shù)脂為適宜的載體，在80 m L液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入聚氨酯樹(shù)脂0.6 g時(shí)所制備的固定化細(xì)胞性能最佳，此時(shí)固定化細(xì)胞干質(zhì)量為0.556 g，培養(yǎng)液酶活為17.4 U/m L;將此固定化細(xì)胞用于催化大豆油甲酯化反應(yīng)，在甲醇與大豆油的質(zhì)量比5∶1、甲醇分批加入(每12 h加1批)的情況下，脂肪酸甲酯收率可達(dá)94%。

1.3.3 復(fù)合脂肪酶協(xié)同催化法制備生物柴油

復(fù)合脂肪酶協(xié)同轉(zhuǎn)酯化作用可解決單一脂肪酶受?；D(zhuǎn)移速率的影響而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率低的問(wèn)題。對(duì)復(fù)合脂肪酶與單一脂肪酶的催化效果進(jìn)行比較研究，可探索出能有效提高脂肪酶轉(zhuǎn)化效率的生物酶法新工藝。周位［49］報(bào)道，在無(wú)溶劑體系中，Novozym 435脂肪酶分別與 Lipozyme TLIM 和Lipozyme RM IM脂肪酶以質(zhì)量比7∶3混合時(shí)，脂肪酸甲酯收率分別達(dá)到94.52%和96.25%，比Novozym 435脂肪酶單獨(dú)使用時(shí)分別提高了9.52%和9.99%。在叔丁醇體系中，當(dāng)Novozym 435與Lipozyme TLIM脂肪酶分別以質(zhì)量比6∶4和8∶2混合時(shí)，脂肪酸甲酯收率分別為85.06%和81.5%，比Novozym 435脂肪酶單獨(dú)使用時(shí)分別提高了9.89%和7.48%;優(yōu)化叔丁醇體系中復(fù)合脂肪酶催化條件后，脂肪酸甲酯收率達(dá)92%。蔣建新等［50］研究了Novozym 435和Lipozyme TLIM混合脂肪酶催化香葉樹(shù)籽油制備生物柴油，以叔丁醇為溶劑，最優(yōu)反應(yīng)條件為：溫度38.5℃、甲醇與油的摩爾比4∶1、叔丁醇與油的體積比1∶1.5、混合脂肪酶用量為油質(zhì)量的 4%，此時(shí)油脂轉(zhuǎn)化率達(dá)90.09%。當(dāng)兩種脂肪酶按質(zhì)量比1∶3混合時(shí)，具有協(xié)同催化作用，既可提高反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，又可降低酶的使用成本。

2 脂肪酶法制備生物柴油的發(fā)展方向

脂肪酶法制備生物柴油已成為國(guó)內(nèi)外研究者關(guān)注的熱點(diǎn)，并已取得很多研究成果，特別是獲得了許多催化活性極高的不同來(lái)源的脂肪酶，為脂肪酶法制備生物柴油的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。今后的研究方向應(yīng)為：(1)對(duì)酶制劑的研究。利用DNA重組技術(shù)可生產(chǎn)重組脂肪酶，降低酶的生產(chǎn)成本，改變其熱穩(wěn)定性、脂肪酸鏈長(zhǎng)度專一性、底物專一性、醇鏈長(zhǎng)度專一性、醇耐受性及pH穩(wěn)定性。對(duì)于已發(fā)現(xiàn)的催化活性高、連續(xù)生產(chǎn)酶活損失少的脂肪酶，還應(yīng)繼續(xù)降低其制造成本和使用成本，即進(jìn)一步提高酶的循環(huán)利用性能。(2)原料的解決。鑒于國(guó)家產(chǎn)業(yè)政策不允許利用食用油生產(chǎn)生物柴油，應(yīng)加大對(duì)非食用油脂及廢棄油脂的研究應(yīng)用，如餐飲廢油、地溝油等的脂肪酶催化轉(zhuǎn)化研究;還可加大以動(dòng)物油脂為原料，使用脂肪酶法制備生物柴油的研究。(3)對(duì)脂肪酶的使用方式進(jìn)行改進(jìn)。脂肪酶固定化技術(shù)的成功與否是脂肪酶法合成生物柴油能否得以工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵，獲得廉價(jià)、易于活化和制備的固定化脂肪酶是今后的研究重點(diǎn)。

3 結(jié)語(yǔ)

隨著石油資源的日益枯竭以及人們對(duì)環(huán)境保護(hù)的日益關(guān)注，可再生、環(huán)境友好的生物柴油已被認(rèn)為是一種新的可替代石化柴油的清潔燃料，國(guó)內(nèi)外已建成了各種規(guī)模的生物柴油生產(chǎn)廠。隨著脂肪酶法合成生物柴油技術(shù)的發(fā)展與產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn)，脂肪酶法制備生物柴油將會(huì)以其高效、安全、節(jié)能、環(huán)保、低成本等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛推廣應(yīng)用。

致謝 本文的完成得到云南師范大學(xué)太陽(yáng)能研究所、生物能源持續(xù)開(kāi)發(fā)利用教育部工程研究中心、云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、云南省農(nóng)村能源工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以及云南師范大學(xué)生物質(zhì)能創(chuàng)新教學(xué)團(tuán)隊(duì)全體成員的大力支持。

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Research Status of Biodiesel Production by Lipase Method and Its Prospect

Wang Changmei，Zhang Wudi，Chen Yubao，Yin Fang，Xu Rui，Liu Shiqing

(Solar Energy Research Institute，Yunnan Normal University，Kunm ing Yunnan 650092，China)

Lipase method for biodiesel production has the advantages of mild reaction conditions，low alcohol use level，easy glycerol recovery，no waste material production and so on.The lipase type (come from animals，plants and microorganisms)，raw oil type(vegetable oils，animal fats，algae oils and waste oils)and the lipase catalysis type(free enzyme catalysis，immobilized enzyme catalysis and composite lipase concerted catalysis)were summarized.It was pointed out that the research of enzyme preparation，sources of the raw materials for biodiesel production and the using method of the lipases would be the tendency of the research and development of biodiesel production catalyzed by lipase.

lipase;biodiesel;enzyme catalysis;transesterification

1000-8144(2011)08-0907-05

TQ 426.97

A

2011-03-15;［修改稿日期］2011-05-28。

王昌梅(1975—)，女，云南省永善縣人，博士生，電話15969431782，電郵 wangcmzf@gmail.com。聯(lián)系人：張無(wú)敵，電話13508714255，電郵wooti@ynnu.edu.cn。

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金項(xiàng)目(2010CD050);云南省能源局“地溝油制取生物柴油裝備研發(fā)及推廣項(xiàng)目”(20102127)。

(編輯 安 靜)

石油化工新材料