P16在子宮頸病變中的應(yīng)用研究進(jìn)展*

薛迎峰 喬云波

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

宮頸癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。在全世界導(dǎo)致婦女死亡的惡性腫瘤中排第二位[1]。分子流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，宮頸癌中99%以上由高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染所致。感染HPV后，多數(shù)可自然清除，少數(shù)發(fā)展為CIN，只有很少的人最終會(huì)發(fā)展為浸潤性宮頸癌。諸多因素包括機(jī)體免疫水平在內(nèi)都會(huì)影響感染的最終結(jié)局。Serrano等于1993年首先克隆出了p16基因的cDNA，編碼相對(duì)分子質(zhì)量為16ku的蛋白質(zhì)，被命名為p16基因[2]。通過對(duì)p16基因研究的不斷深入，有人認(rèn)為p16在抑癌方面的重要性甚至超過p53和Rb(Retinablastoma gene)基因[3、4]。HPV感染宮頸細(xì)胞并誘導(dǎo)癌變中，細(xì)胞周期發(fā)生功能紊亂，其中P16INK4a可作為一個(gè)非常有效的宮頸細(xì)胞核異常的生物學(xué)標(biāo)志物，來預(yù)測(cè)CIN的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸以及預(yù)后，用P16INK4a在CIN組織中的表達(dá)來發(fā)現(xiàn)和標(biāo)識(shí)潛在病情發(fā)展的高?；颊?，對(duì)其進(jìn)行合理的治療及密切隨訪，減少低?；颊叩倪^度治療及不必要隨診，對(duì)臨床具有重要價(jià)值。

1 P16INK4a

1、1 P16位點(diǎn)的基因組結(jié)構(gòu)

P16基因位于人類染色體9P21，長8.5 kb，包含2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)長度分別為126 bp、307 bp和11 bp的外顯子[5]。P16蛋白N端與細(xì)胞周期蛋白(cyclin)p-box的N端具有部分同源性[5]。P16蛋白的錨蛋白重復(fù)序列是與目標(biāo)分子相互作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)P16的抑癌功能非常重要是維持其活性所必須的結(jié)構(gòu)，錨蛋白重復(fù)序列與CDK的相互作用可以抑制細(xì)胞周期素D(cyclin D)的活性，在它序列之外的缺失對(duì)P16基因突變體蛋白產(chǎn)物的功能無明顯影響[6]。

1、2 P16蛋白抑癌功能的作用機(jī)理

P16抑制細(xì)胞周期的作用主要通過cyclinD-CDK4/6- pRb-E2F途徑來實(shí)現(xiàn)。CDK本身沒有活性，只有與細(xì)胞周期素(cyclin)結(jié)合或亞單位磷酸化后才具有活性，在cyclin中最重要的是cyclinD。CDK4/6與合成的cyclinDl結(jié)合被激活，激活后的CDK4/6-cyclinDl復(fù)合物具有催化活性，可使pRb磷酸化，并且可通過各種途徑調(diào)節(jié)磷酸化的活性，磷酸化后的pRb失去對(duì)轉(zhuǎn)錄因子E2F的抑制能力，誘導(dǎo)E2F依賴性基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因的產(chǎn)物促進(jìn)DNA的合成和細(xì)胞的分化，使細(xì)胞通過G1-S期，進(jìn)入S期。CDK受到抑制就不能磷酸化pRb，低磷酸化的pRb不能與E2F分離，促進(jìn)DNA合成的基因轉(zhuǎn)錄受到阻止，這樣非磷酸化或低磷酸化的pRb可阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)人S期。由抑癌基因pl6編碼的P16蛋白可以與cyclinD競爭性結(jié)合CDK4/6，結(jié)合后CDK4/6的活性被抑制，pRb不能磷酸化，阻止DNA的合成使細(xì)胞停滯在G1期。如果CDK得不到抑制，則導(dǎo)致細(xì)胞不斷增殖[7]。然而P16在cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F細(xì)胞周期調(diào)節(jié)途徑中起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，當(dāng)高磷酸化的pRb增多會(huì)誘導(dǎo)P16INK4a的高表達(dá)，又可通過與CDK4/6結(jié)合減少pRb的磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期平衡，阻止腫瘤發(fā)生。細(xì)胞分裂次數(shù)的積累和癌基因的激活，使P16INK4a的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上提高。當(dāng)表達(dá)水平足夠高時(shí)就能抑制細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而防止細(xì)胞無限制分裂。同時(shí)細(xì)胞處于惡劣環(huán)境或DNA受到損傷時(shí)，P16INK4a的表達(dá)水平也上升，以防止異常細(xì)胞進(jìn)人細(xì)胞周期。

1、3 P16INK4a的失活

P16INK4a失活的原因主要有4種:(1)純合性缺失，約占人類腫瘤的14%。(2)雜合性缺失。(3)基因內(nèi)突變，約占人類腫瘤的5%。(4)啟動(dòng)子的甲基化，主要發(fā)生在INK4a的啟動(dòng)子上，導(dǎo)致INK4a轉(zhuǎn)錄活性完全喪失，約占人類腫瘤的19%[8]。TriPathi A[9]對(duì)46例宮頸癌患者的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，P16基因的失活率為33%。其中甲基化率為15%，突變率為6.5%，純合子缺失率為8.7%。

2 P16INK4a與HPV感染的關(guān)系

通過免疫組織化學(xué)方法測(cè)得，P16在宮頸癌中的表達(dá)與其他腫瘤不同，存在P16蛋白的高表達(dá)，且隨著宮頸癌病情的發(fā)展呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)[10-11]。有學(xué)者認(rèn)為P16在宮頸癌中的高表達(dá)可能與HPV的感染有關(guān)。Ishikawa等[12]應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)CINⅠ、CINⅡCINⅢ及SCC中hr-HPV的感染率，結(jié)果分別為69.8%(37/53)、97.5%(39/40)、91.7%(44/48)和100%(16/16)；并應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法同時(shí)檢測(cè)hr-HPV陽性的CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和SCC中P16表達(dá)陽性率分別是32.4%(12/37), 82.1%(32/39), 93.2%(41/44)和100% (16/16)。分析因?yàn)樵赑16INK4a-cyclinD1-CDK4/6- pRb精細(xì)調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)中，P16INK4a可通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制表達(dá)上調(diào), pRb-E2F復(fù)合物抑制基因P16INK4a本身的轉(zhuǎn)錄，所以無論是通過點(diǎn)突變還是蛋白與蛋白之間的相互作用導(dǎo)致pRb功能的丟失，都會(huì)使P16INK4a失去負(fù)反饋抑制，其轉(zhuǎn)錄和翻譯會(huì)相應(yīng)提高。而表現(xiàn)為過表達(dá)。

3 pl6INK4a與臨床

3、1 P16在宮頸癌篩查中的應(yīng)用

現(xiàn)在宮頸癌的早期篩查多用hr-HPV或細(xì)胞學(xué)聯(lián)合檢測(cè)，已有文獻(xiàn)報(bào)道為了避免形態(tài)學(xué)診斷的主觀性同時(shí)用P16檢測(cè)以提高準(zhǔn)確性。Pientong等[13]比較了165例宮頸細(xì)胞學(xué)檢查中P16免疫細(xì)胞染色，同時(shí)研究P16過表達(dá)和HR-HPV感染的關(guān)系，檢測(cè)結(jié)果NILM、ASCUS、LSIL、HSIL和SCC中P16陽性率分別為：0，52.5%，54.3%，100%和100%，HPV陽性率分別為10%，45%，57%，70%和86.7%。而且在hr-HPV陽性的HSIL和SCC中，P16過表達(dá)率均為100%。因此，宮頸細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合P16免疫細(xì)胞化學(xué)染色更為準(zhǔn)確、實(shí)用。P16過表達(dá)可以看做是hr-HPV感染細(xì)胞后啟動(dòng)癌變程序標(biāo)志，可以協(xié)助HPV檢測(cè)對(duì)宮頸上皮內(nèi)高度病變預(yù)測(cè)假陽性率高和細(xì)胞學(xué)檢測(cè)假陰性率高的不足，而且其檢測(cè)方法簡單、經(jīng)濟(jì)，易于操作，因此，P16INK4a將會(huì)成為一種很有前途的生物學(xué)標(biāo)志物。

3、2 P16在宮頸病變?cè)\斷及鑒別診斷中的應(yīng)用

目前宮頸病變的病理診斷受主觀偏差影響，其結(jié)果差異較大導(dǎo)致臨床治療不足或過度治療，而且CINⅠ和CINⅡ的區(qū)別僅靠形態(tài)學(xué)診斷是不可靠的有時(shí)在形態(tài)學(xué)上符合低級(jí)別但生物學(xué)進(jìn)程卻符合高級(jí)別。Klaes等[14]隨機(jī)挑選190例宮頸錐切標(biāo)本， 5位病理學(xué)家分別閱片，組織病理診斷一致的僅有130例，其中浸潤癌，CINⅢ、Ⅱ、Ⅰ的診斷符合率分別為94%，72%，35%和52%?？梢钥闯?級(jí)別越低符合率越低。而通過免疫染色診斷的符合率均大于90%，為P16免疫組織化學(xué)方法作為宮頸病變活檢病理診斷輔助檢查提供依據(jù)。

3、3 P16在基因治療中的應(yīng)用

Arapn[15]用P16INK4a轉(zhuǎn)染有pl6INK4a基因失活的癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞生長出現(xiàn)抑制，這為用P16INK4a基因治療腫瘤提供了線索。有學(xué)者認(rèn)為P16INK4a基因分子較小，易于操作，作用對(duì)象單一，可特異性地抑制CDK4和CDK6，可以作為抗腫瘤藥物具有專一性的靶子。以P16INK4a基因作為目的基因的基因替代治療，以及針對(duì)pl6INK4a基因甲基化失活的治療，將在包括宮頸癌在內(nèi)的人類的基因治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

[1] Ruud L.M. Bekkers,et al.Epidemiological and clinical aspects of human papillomavirus detection in the prevention of cervical cancer[J].Review in Medical Virology,2004，14(2):95-105.

[2] Hirama T, Koeffler HP. Role of the cyclin-dependent kinase inhibitors in the development of cancer[J]. Blood. 1995 Aug 1; 86(3):841-54. Review. No abstract available.

[3] Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types[J].Science, 1994， 15;264(5157):436-440.

[4] Nobori T, Miura K, Wu DJ, et al. Deletions of the cyclin-dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple humancancers[J]. Nature, 1994, 368 (6473): 753-756.

[5] Serrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4[J]. Nature, 1993, 366(6456):704-707.

[6] Lew DJ, Dulic V, Reed SI. Isolation of three novel human cyclins by rescue of Gl cyclin (Cln) function in yeast[J]. Cell,1991, 66(6):1197-1206.

[7] Sherr CJ. Mammalian G1 cyclins[J]. Cellj 1993 Jun 18; 73(6):1059-65. Review. No abstract available.

[8] Ruas M, Peters G. The P16INK4a/CDKN2A tumor suppressor and its relatives[J]. Biochim Biophys Acta. 1998 Oct 14;1378(2):F115-77. Review. No abstract available.

[9] Tripathi A, Banerjee S, Roy A, et al. Alteration of the P16 gene in uterine cervical carcinoma from Indian patients[J]. Int J Gynecol Cancer, 2003, 13; 472-479.

[10] R Klaes, TFriedrich, Spitkovaky, et al. Over expression P16INK4aas a specific marker for dysplastic and neoplastic epithelial cells of the cervix uetri [J]. Int J Cancer, 2001, 92(2): 276-284.

[11] Tringler B, Gup CJ, Singh M, et al. Evaluation of P16INK4aand pRb expression in cervical squamous and glandular neoplasia [J]. Hum Pathol,2004, 35(6):689-696.

[12] Ishikawa M, Fujii T, Saito M, et al. Overexpression of p16 INK4a as an indicator for human papillomavirus oncogenic activity in cervical squamous neoplasia[J]. Int J Gynecol Cancer, 2006, 16(1): 347-353.

[13] Pientong C，Ekalaksananan T，Kongyoes B，et al，lmmu- noeytochemical Staining of pl6INK4a protein on conventional Pap test and its association with Human papillomavirus infection[J]. Dia, Cytopathol, 2004, 31(4):235-242.

[14] Klaes R，Bennner A，F(xiàn)riedrich T，et al. pl6INK4a immuno- histochemistry improves Interobserver agreement in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia[J]. Am J Surg Pathol, 2002, 26(11):1389-1399.

[15] Rap W, Nishikana R. Replacement of the p16/cdkn2 gene surpresses human glioma cell growth [J]. Cancer Res, 1995: 55(2): 1351-1354.