植物高光效基因工程研究進(jìn)展

張忠梁，張名昌，白云鳳，閆建俊，馮瑞云

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030032）

植物的光合產(chǎn)物是人類賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)。根據(jù)光合作用中CO2的同化途徑，植物可分成C3，C4和CAM三類。C3植物通過1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）催化1,5-二磷酸核酮糖（RuBP）羧化，直接同化大氣中的CO2，產(chǎn)生2個三碳化合物3-磷酸甘油酸，該途徑稱為C3途徑（或卡爾文循環(huán)）[1]。Rubisco還催化加氧反應(yīng)，使羧化合成的碳水化合物被氧化，固定的能量重新被釋放。Rubisco催化反應(yīng)的雙重性以及對CO2的高Km值是C3植物低光合效率的主要原因。C4植物CO2的初始固定由位于葉肉細(xì)胞的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）所催化，該酶對CO2的結(jié)合能力特別強(qiáng)，催化空氣中的CO2與其受體磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）形成四碳化合物草酰乙酸（OAA），該途徑稱為C4途徑。在C4途徑中，OAA經(jīng)葉綠體中的NADP-蘋果酸脫氫酶（NADP-MDH）還原為蘋果酸（MA），MA再轉(zhuǎn)運(yùn)至鞘細(xì)胞中脫羧，釋放出的CO2進(jìn)入C3循環(huán)被Rubisco固定，而余下的三碳產(chǎn)物（丙酮酸）重新運(yùn)回葉肉細(xì)胞的葉綠體內(nèi)，在磷酸丙酮酸二激酶（PPDK）催化下形成CO2受體PEP。C4循環(huán)增加了維管束鞘細(xì)胞中CO2的濃度，同時(shí)提高了Rubisco的羧化活性，抑制了它的加氧活性，使C4植物保持較高的光合效率[2]。

一些主要農(nóng)作物如水稻、小麥、馬鈴薯、甜菜等均為C3作物，較低的光合效率成為限制其產(chǎn)量進(jìn)一步提高的重要內(nèi)在因素之一。通過提高光合作用效率來增加作物產(chǎn)量一直是國際上光合作用研究和作物遺傳育種研究的熱點(diǎn)之一。自20世紀(jì)60年代以來，人們試圖通過常規(guī)雜交育種手段來改進(jìn)C3植物的光合效率，但未取得預(yù)期結(jié)果。近年來，基因克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)逐步完善，為改善作物光合效率提供了新途徑。本文就該方面的研究進(jìn)展作一綜述。

1 Rubi sco的修飾與改造

Rubisco廣泛分布于具有光合功能的細(xì)胞器中。在C3植物中，Rubisco主要存在于葉肉細(xì)胞的葉綠體間質(zhì)中，在基粒片層上也有少量分布。在C4植物中，Rubisco則定位于維管束鞘細(xì)胞中的葉綠體間質(zhì)內(nèi)。Rubisco由多個大亞基和小亞基組成，大亞基具有催化功能，小亞基僅具有調(diào)節(jié)作用。Rubisco催化C3途徑的第1步，即把CO2分子共價(jià)結(jié)合到底物RuBP（1，5-二磷酸核酮糖）上，形成3-磷酸甘油酸。但其羧化反應(yīng)速度每秒只有2～3次，與一般的酶促反應(yīng)速度（每秒25 000次左右）相比，效率極低。Rubisco是一種雙功能酶，還催化另外1個反應(yīng)（即加氧反應(yīng)，即Rubisco不與CO2結(jié)合而是與O2結(jié)合，除消耗能量外，還損失羧化反應(yīng)中固定的20%～50%的有機(jī)碳）。

提高Rubisco同化CO2的效率，抑制其加氧功能，無疑會提高作物產(chǎn)量。許多研究者希望通過基因定點(diǎn)突變改變酶的結(jié)構(gòu)，以改變Rubisco羧化/加氧的比值，但至今仍未獲得成功，突變后的酶活性并未顯著提高。1994年，Read和Tabita發(fā)現(xiàn)在硅藻和紅藻中存在的Rubisco具有比高等植物高得多的效率。此后，Uemura等又發(fā)現(xiàn)一種嗜熱紅藻的Rubisco羧化效率約是高等植物的2.5～3倍。在紅藻中發(fā)現(xiàn)的具有較高效率的Rubisco，為修飾改造Rubisco提供了依據(jù)。Whitney等[3]通過質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將紅藻Rubisco的小亞基編碼基因引入煙草的葉綠體中，得到了高效表達(dá)，但是表達(dá)的小亞基卻不能與煙草本身的大亞基組裝成全酶。因此，要提高Rubisco的效率需要進(jìn)一步了解該酶的蛋白結(jié)構(gòu)與其催化效率之間的關(guān)系及其大小亞基組裝成全酶的修飾機(jī)制。

2 C4光合途徑中關(guān)鍵酶基因的克隆與轉(zhuǎn)化

C4光合途徑中主要涉及3種關(guān)鍵酶，即磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、磷酸丙酮酸二激酶（PPDK） 和依賴于 NADP的蘋果酸酶（NADP-ME）。PEPC可分為C4型、C3型和根型。C4型主要負(fù)責(zé)C4雙羧酸循環(huán)途徑中固定CO2的初始反應(yīng)，C4光合循環(huán)的關(guān)鍵限速酶[4]。將玉米的C4型PEPC基因?qū)胨?，葉片的PEPC活性提高了20倍[5]，甚至提高110倍[6]；導(dǎo)入小麥，酶活性提高了3～5倍[7]；導(dǎo)入煙草，酶活性最高提高了2.4倍。將高粱的C4型PEPC基因?qū)胨荆富钚蕴岣?～10倍[8]，導(dǎo)入擬南芥[9]，PEPC的活性也比對照有不同程度的提高。將甘蔗的PEPC基因?qū)霟煵?，酶活性提?.5倍[10]。

PPDK分為C4型和胞質(zhì)型。C4型PPDK基因與胞質(zhì)型PPDK基因往往有部分重疊[11]，如玉米C4型PPDK基因與胞質(zhì)型PPDK基因的大部分序列相同，區(qū)別在于C4型PPDK基因的上游比細(xì)胞質(zhì)型PPDK基因多1個外顯子和1個內(nèi)含子，外顯子編碼1個葉綠體導(dǎo)肽，而內(nèi)含子的部分序列則成為細(xì)胞質(zhì)型PPDK基因的啟動子，具有組成型轉(zhuǎn)錄活性[12]。將玉米的C4型PPDK基因轉(zhuǎn)入水稻，PPDK的最高酶活力提高了40倍[13]；轉(zhuǎn)入馬鈴薯，PPDK的最高酶活力提高了5.4倍；轉(zhuǎn)入擬南芥，酶活力提高了4倍。

NADP-ME由1個小的基因家族編碼。C4型NADP-ME位于維管束鞘細(xì)胞的葉綠體的基質(zhì)中，通過其脫羧反應(yīng)生成的CO2被Rubisco重新固定而進(jìn)入C3循環(huán)，是C4途徑的另一關(guān)鍵酶。高粱和玉米[14]的NADP-ME基因均在水稻植株中得到了有效表達(dá)，水稻轉(zhuǎn)基因植株的生物學(xué)產(chǎn)量不僅顯著高于非轉(zhuǎn)基因水稻植株，也高于轉(zhuǎn)PEPC基因和PPDK基因的水稻植株[15]。

3 植物高光效基因工程面臨的挑戰(zhàn)

C4關(guān)鍵酶基因向C3作物的成功導(dǎo)入及其在C3作物中的高效表達(dá)，說明利用基因工程手段培育高光效作物品種的可行性，但仍有許多問題需要進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。如Ku等得到的轉(zhuǎn)基因水稻，其PEPC活力可達(dá)玉米的2～3倍，但是除了其抗氧抑制的能力有所增強(qiáng)外，并未發(fā)現(xiàn)光合效率有所提高。轉(zhuǎn)基因植物中PEPC活力的提高，必然使其產(chǎn)物——草酰乙酸（OAA）的濃度升高；如果生成的OAA不能迅速脫羧或被轉(zhuǎn)運(yùn)掉，其PEPC活力就會被OAA強(qiáng)烈抑制，因而就難以實(shí)質(zhì)性地啟動單細(xì)胞內(nèi)的四碳雙羧酸微循環(huán)而有效提高轉(zhuǎn)基因作物中四碳雙羧酸濃度，最終不能有效提高光合效率。這些結(jié)果表明，要顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的光合效率，需要引入完整運(yùn)行的C4循環(huán)。為此，需要導(dǎo)入多個C4基因并使其協(xié)調(diào)表達(dá)，或者把含不同C4基因的植株彼此雜交，聚合C4基因。

分析C4基因超量表達(dá)的例子，發(fā)現(xiàn)單子葉植物玉米、高粱的C4基因在水稻、小麥等單子葉植物中的表達(dá)水平一般高于在雙子葉植物如煙草、擬南芥中的表達(dá)水平，表明系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上的距離有可能影響C4基因在C3植物中的高效表達(dá)。對單子葉植物玉米的密碼子用法分析表明，其與水稻、小麥等單子葉植物的密碼子用法比較一致，與擬南芥、煙草等雙子葉植物差異較大[16]。對雙子葉植物籽粒莧NAD-ME的密碼子用法的研究，發(fā)現(xiàn)它與馬鈴薯、擬南芥、葡萄等雙子葉植物的用法較為一致，與玉米、高粱等單子葉植物差異較大[17]。密碼子偏好性是生物在長期的進(jìn)化過程中為適應(yīng)宿主的基因組環(huán)境而形成的。因此，如何選擇高光效基因的適宜供體和受體應(yīng)是高光效基因工程考慮的重要因素之一。

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