蜂膠活性成分及質(zhì)量控制的研究進(jìn)展

北京市保健品化妝品技術(shù)審評(píng)中心（100055） 李強(qiáng) 劉東紅

蜂膠（propolis）是蜜蜂從植物芽孢或樹干破皮傷處采集來的樹脂（樹膠），并混入蜜蜂上顎腺的分泌物，與蜂蠟、少量花粉等加工而成的一種具有芳香氣味和黏性的膠狀固體物質(zhì)[1]。蜂膠是蜜蜂用于維持整個(gè)群體健康的有效物質(zhì)，一個(gè)5～6萬只的蜂群一年只能生產(chǎn)蜂膠100～150g，被譽(yù)為“紫色黃金”。蜂膠因其化學(xué)成分復(fù)雜且生物學(xué)活性廣泛而成為國內(nèi)外研究與開發(fā)的熱點(diǎn)。

天然蜂膠的基本成份： 樹脂50%～55%，蜂蠟30%～40%，花粉5%～10%。主要活性成分有黃酮類化合物（槲皮素、蘆丁、山奈黃素、白楊黃素、芹菜素、高良姜素、松屬素等）、萜烯類、有機(jī)酸（阿魏酸、咖啡酸、苯甲酸等）、脂肪酸（10-羥基-α-癸烯酸等）、氨基酸、胰蛋白酶等活性酶類、維生素、多糖、30多種微量元素和礦物質(zhì)等共200余種有效成分[2][3]。

蜂膠具有抗感染、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、抗輻射；降血脂、降血糖、降血壓、降膽固醇；增強(qiáng)免疫、清除自由基、美容、促進(jìn)組織再生等作用[4][6]。蜂膠在臨床內(nèi)科、外科、皮膚科、耳鼻喉科、婦科、內(nèi)分泌及代謝性疾病等均有應(yīng)用[5][6]。

蜂膠制品有兩類，一類是以水為載體的，即所謂水溶性蜂膠；另一類是以酒精為載體的，即所謂醇溶或酒精溶的蜂膠。原膠（即從蜂箱中直接取出的蜂膠）中含有雜質(zhì)，而且重金屬含量較高，不能直接食用，必須經(jīng)過提純、去雜、去除重金屬如鉛等之后，才可用于加工生產(chǎn)各種蜂膠制品。蜂膠的活性成分因產(chǎn)地、氣候、儲(chǔ)存方式、提取工藝的不同而不同，從而使蜂膠質(zhì)量和功效存在差異。

蜂膠的質(zhì)量控制貫穿于收購和加工的全過程，隨著現(xiàn)代各種檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是近年來色譜技術(shù)的日益發(fā)展、檢測手段和能力的不斷增強(qiáng)，為蜂膠中有效成分含量測定的研究提供了良好的工作平臺(tái)。采用先進(jìn)的現(xiàn)代分析技術(shù)色譜、光譜、電泳技術(shù)以及聯(lián)用技術(shù)，如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、高效毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，通過現(xiàn)代儀器分析方法，分析蜂膠中的有效成分和特有的芳香物質(zhì)，建立起相應(yīng)的科學(xué)的質(zhì)量技術(shù)評(píng)價(jià)平臺(tái)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)平臺(tái)，最終推廣到行業(yè)應(yīng)用，從而確保蜂膠質(zhì)量穩(wěn)定可控，使蜂膠這一寶貴的資源能更好地造福于人類?，F(xiàn)對(duì)蜂膠活性成分及其質(zhì)量控制的幾個(gè)問題做以下總結(jié)：

1 蜂膠感官的判別

農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)《無公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）[1]中規(guī)定蜂膠為不透明團(tuán)塊或碎片，在35℃以上逐漸變軟，有粘性和可塑性，有明顯的芳香氣味，顏色由于樹種或生產(chǎn)季節(jié)不同呈褐色、灰褐、暗綠、灰黑色等，有光澤，有明顯的辛辣感。GB/T24283-2009《蜂膠》[7]除了對(duì)蜂膠的感官有上述描述外，還對(duì)蜂膠的乙醇提取物的感官進(jìn)行了規(guī)定。商業(yè)部頒發(fā)的《蜂膠》（SB/T10096-92）[8]、《蜂蠟》（SB/T10190-93）[9]則根據(jù)感官性狀對(duì)蜂膠進(jìn)行了分級(jí)。

2 蜂膠中黃酮類物質(zhì)的含量

蜂膠產(chǎn)品中的蜂膠含量是有一定比例的，總黃酮含量是一個(gè)標(biāo)志性成分指標(biāo)，農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)《無公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）規(guī)定總黃酮含量8%，GB/T24283-2009《蜂膠》中按照總黃酮含量和乙醇提取物含量的不同對(duì)蜂膠和蜂膠乙醇提取物分了二級(jí)?！稛o公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）使用高效液相色譜法測定蜂膠中常見的高良姜素（galangin）、槲皮素（quercetin）、蘆?。╮utin）、楊梅酮（myricetin）、莰菲醇（kaempferol）、芹菜素（apigenin）、松屬素（pinocembrin）、柯因（chrysine）等8種黃酮含量，計(jì)算總和為總黃酮含量。該方法同國家質(zhì)檢總局國家蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心頒布的GB/T19427-2003[10]中的液相方法基本一致，GB/T19427-2003同時(shí)還制訂了該8種黃酮的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法的測定方法。GB/T24283-2009《蜂膠》則以蘆丁為對(duì)照，采用分光光度比色法測定總黃酮的含量，GB/T20574-2006[11]亦是采用分光光度比色法測定蜂膠中總黃酮的含量。

王小平等[12]用高效液相色譜法建立蜂膠指紋圖譜分析方法，用以鑒別蜂膠和樹膠，采用蜂膠黃酮類物質(zhì)中主要成分蘆丁、槲皮素、白羊素、高良姜素作為觀察指標(biāo)，方法學(xué)考察中精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)色譜圖的相似度均大于0.95。對(duì)蜂膠HPLC色譜圖進(jìn)行解析，確定有13個(gè)共有峰，構(gòu)筑了蜂膠藥材的HPLC色譜圖的指紋特征，可作為蜂膠鑒別的依據(jù)。蜂膠和樹膠同源，其主要化學(xué)成分基本相同但是相對(duì)含量有所不同，通過對(duì)10批蜂膠和3批樹膠圖譜的研究，發(fā)現(xiàn)蜂膠中有兩種成分均甚微，而3批樹膠中該兩峰均較高，以此可對(duì)真假蜂膠進(jìn)行鑒別。朱恩圓等[13]采用RP-HPLC梯度洗脫的方法對(duì)蜂膠總黃酮進(jìn)行研究，對(duì)不同產(chǎn)地的蜂膠指紋圖譜比較選出10個(gè)穩(wěn)定的且具有代表的峰作為共有峰，建立了蜂膠的指紋圖譜。沙娜等[14]應(yīng)用反相高效液相色譜法使蜂膠中各成分得到較好的分離，根據(jù)檢測結(jié)果確定了15個(gè)共有指紋峰，并指認(rèn)了其中的14個(gè)成分，分別為咖啡酸、對(duì)香豆酸、異阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、5-甲氧基短葉松素、短葉松素、喬松素、咖啡酸卞酯、5-甲氧基高良姜素、白楊素、咖啡酸苯乙基酯、高良姜素、3-甲氧基高良姜素、咖啡酸桂皮酰酯，建立蜂膠藥材指紋圖譜,對(duì)蜂膠進(jìn)行質(zhì)量控制。李熠等[15]采用超高效液相色譜法能夠同時(shí)測定蜂膠中的黃酮類物質(zhì)如蘆丁、楊梅酮、桑色素、棚皮素、茨菲醇、芹菜素、松屬素、柯因、高良姜素、金合歡素、酸類物質(zhì)如阿魏酸以及脂類物質(zhì)咖啡酸苯乙酯等12種成分的含量，提供了一種更為全面的評(píng)價(jià)蜂膠質(zhì)量的新方法。薛曉麗[16]則通過使用高效液相色譜法和氣-質(zhì)聯(lián)用分析儀將現(xiàn)代的超臨界CO2流體提取工藝與傳統(tǒng)的乙醇浸出提取工藝相比較。結(jié)果表明，兩種方法都有利于蜂膠有效化學(xué)成分的提取，乙醇浸出提取工藝有利于提取蜂膠中黃酮類物質(zhì)，超臨界CO2流體提取工藝有利于蜂膠中化學(xué)成分的分析，應(yīng)根據(jù)提取活性成分的主次及具體情況進(jìn)行選擇單體成分和指紋圖譜研究，建立指紋圖譜庫。

20世紀(jì)80年代初發(fā)展的毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophoresis，CE）是以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間的遷移速度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)，比較HPLC測定法，高效毛細(xì)管電泳法可以更好地分離多種黃酮類化合物，并可以對(duì)糖類、有機(jī)酸類同時(shí)進(jìn)行測定[17]，與HPLC互補(bǔ)可以測定蜂膠中的芳香類化合物如酯類化合物、糖、糖醇類化合物、氨基酸、脂肪酸及黃酮類的含量。

3 蜂膠中揮發(fā)性成分的研究

蜂膠中香氣揮發(fā)性成分有萜烯類、醇、醛、酮、酯等類別，其揮發(fā)性成分是一個(gè)重要的質(zhì)量指標(biāo)，具有指紋特征。傳統(tǒng)的揮發(fā)性有機(jī)物富集方法為水蒸氣蒸餾和同時(shí)蒸餾萃取，不能滿足快速分析的要求。王小平等[18]采用GC-MS法分別對(duì)不同產(chǎn)地蜂膠乙醚索氏提取法所得提取物的化學(xué)成分進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)蜂膠的產(chǎn)地、生態(tài)環(huán)境等條件與蜂膠揮發(fā)油種類及含量密切相關(guān)，可考慮通過選擇蜂場附近的生態(tài)環(huán)境如主要樹木種類等，改善蜂膠產(chǎn)品的質(zhì)量。李雅萍等[19]利用固相微萃取（SPME）對(duì)蜂膠揮發(fā)性成分進(jìn)行提取，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)提取物進(jìn)行定性定量研究，并與溶劑（乙醇、乙酸乙脂）提取法對(duì)蜂膠揮發(fā)性成分特別是萜烯類物質(zhì)的提取效果進(jìn)行了比較，建立了SPME-GC/MS聯(lián)用技術(shù)分析蜂膠中香氣揮發(fā)性成分的方法，得到較理想的結(jié)果。利用SPME-GC/MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地采集期的蜂膠成分進(jìn)行分析，提取有用的指紋信息，為進(jìn)一步分析蜂膠某些成分的藥用價(jià)值及蜂膠的開發(fā)利用及指紋圖譜的建立提供依據(jù)。趙強(qiáng)等[20]采用超臨界CO2萃取和冷凍分離得到蜂膠揮發(fā)油，用化學(xué)發(fā)光法測定蜂膠揮發(fā)油對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基的清除性能，并用色質(zhì)聯(lián)用法分析其化學(xué)組成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蜂膠揮發(fā)油能有效抑制羥自由基和超氧陰離子自由基誘導(dǎo)的化學(xué)發(fā)光，通過GC-MS分析鑒定出51種化合物。

4 蜂膠中蜂蠟的研究

蜂蠟在蜂膠中占3 0%～4 0%，農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)《無公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）中規(guī)定蜂蠟和75%乙醇不溶物含量≤45%。該標(biāo)準(zhǔn)采用重量法測定75%乙醇可溶物含量后，采用減量法測定了蜂蠟和75%乙醇不溶物含量。駱尚驊[21]在《蜂膠質(zhì)量控制的幾個(gè)指標(biāo)和檢測方法》一文中采用索氏提取-重量法測定了蠟類含量。

5 蜂膠中酚酸類化合物的研究

有機(jī)酸成分也是蜂膠的活性成分，其含量的變化也會(huì)影響蜂膠質(zhì)量，蜂膠中的有機(jī)酸如苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、香草酸、肉桂酸、綠原酸等，具有強(qiáng)烈的抗病原微生物和保護(hù)動(dòng)物肝臟的作用，與蜂膠中黃酮類物質(zhì)起協(xié)同作用。索志榮[22]采用高效液相色譜分析方法測定了蜂膠浸膏中咖啡酸、p-香豆酸、反式阿魏酸、肉桂酸、喬松素、白楊素和高良姜素7種多酚化合物的，并用該方法測定我國不同省份的9個(gè)蜂膠浸膏樣品，為評(píng)價(jià)和控制蜂膠的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。孟霞等[23]建立了高效液相色譜同時(shí)測定蜂膠中的苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、香草酸、肉桂酸、綠原酸的方法，用于實(shí)際樣品分析，取得較好結(jié)果，為測定蜂膠液中有機(jī)酸類物質(zhì)提供了方法依據(jù)。國家質(zhì)檢總局頒布了《蜂膠中阿魏酸含量的測定方法液相色譜-紫外檢測法》GB/T23196-2008[24]。周立東等[25]則采用弱堿溶解蜂膠再酸化萃取的方法純化樣品，用返滴法測定，以水楊酸作為對(duì)照品檢測樣品中游離酸含量，結(jié)果測定了5個(gè)不同產(chǎn)地的蜂膠樣品的游離酸含量，方法操作簡單，有助于蜂膠質(zhì)量的鑒別。賀崢嶸等[26]則采用紫外分光光度儀、傅立葉變換紅外光譜儀以及核磁共振譜儀等不同分析技術(shù)對(duì)貴州蜂膠中的有機(jī)酸成分進(jìn)行了研究。HROBONOVA Katarina等[27]采用在線固相萃取-液相色譜法測定了蜂膠中芥草酸、奎尼酸、綠原酸、迷迭香酸、對(duì)羥基苯甲酸等有機(jī)酚酸類物質(zhì)，只有對(duì)羥基苯甲酸沒有檢出。

6 氧化時(shí)間

國內(nèi)外大量的科學(xué)研究證明，蜂膠對(duì)機(jī)體的諸多保健功效與其抗氧化活性有著密切的關(guān)系。因此，蜂膠的抗氧化活性特別受到研究者的關(guān)注和重視。農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)《無公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）、商業(yè)部頒發(fā)的《蜂膠》（SB/T10096-92）《蜂蠟》（SB/T10190-93）以及國家質(zhì)檢總局頒布的《蜂膠》（GB/T24283-2009）均對(duì)氧化時(shí)間進(jìn)行了規(guī)定，并提供了相應(yīng)的檢測方法。

7 其他方面

資料表明，還可以對(duì)蜂膠的灰分、酶活力、維生素、微量元素以及礦物質(zhì)進(jìn)行分析測定[21,28～31]。對(duì)于蜂膠浸提液，還應(yīng)增加乙醇含量和比重[32]的檢測，從而使蜂膠質(zhì)量的控制更加全面。

8 有毒有害物質(zhì)

在蜂膠質(zhì)量評(píng)定中，不僅要對(duì)蜂膠的感官性狀進(jìn)行觀察、對(duì)天然活性成分進(jìn)行分析檢測，還要把有毒物的殘留如鉛、砷、汞、鎘等重金屬污染和農(nóng)藥殘留以及霉菌、致病菌等指標(biāo)也應(yīng)作為質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)《無公害食品-蜂膠》（NY5136-2002）對(duì)蜂膠中的微生物指標(biāo)及檢驗(yàn)方法、重金屬指標(biāo)及檢驗(yàn)方法、農(nóng)藥殘留指標(biāo)及檢驗(yàn)方法均進(jìn)行了規(guī)范。國家質(zhì)檢總局頒發(fā)了GB/T23870-2009[33]，采用微波消解-石墨爐原子吸收分光光度法測定蜂膠中的鉛。已有研究證明，利用固相萃取法處理樣品，電子捕獲-氣相色譜法測定了蜂膠中17種有機(jī)氯殺蟲劑，定量限在2.6～38.1μg/kg之間，平均回收率為62.6～109.6%，RSD%為0.8～9.4%，4,4′-DDE在很多種峰膠中被檢出。