MicroRNA在白血病中作用的研究進(jìn)展

韓若喬， 高 艾， (首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與家庭醫(yī)學(xué)學(xué)院， 北京 00069;北京市臨床流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;通訊作者，E-mail:gaoai48@ccmu.edu.cn.)

microRNA(miRNA)，是一種21－25 nt長的單鏈小分子非編碼RNA［1］。它廣泛存在于真核生物中，可通過堿基配對(duì)的方式結(jié)合到靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)，從而降解靶mRNA或抑制其翻譯，但不影響其轉(zhuǎn)錄［2］。miRNA的主要功能是調(diào)節(jié)與個(gè)體生長、發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關(guān)的基因的表達(dá)，參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，包括早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡、脂肪代謝和細(xì)胞分化［3］。越來越多的研究顯示，miRNA在白血病中起著癌基因和抑癌基因的作用。本文對(duì)miRNA在人類白血病發(fā)生中作用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 miRNA與白血病的關(guān)系

1.1 miRNA具有抑癌基因的功能

1.1.1 miR-15和 miR-16 第一個(gè)有關(guān) miRNA與癌癥的報(bào)道，是Calin等［4］發(fā)現(xiàn)成人慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，B-CLL)患者的染色體13q14.3一個(gè)30 kb的區(qū)域內(nèi)常伴有兩個(gè)miRNA基因miR-15和miR-16的缺失或下調(diào)。之后，Cimmino等［5］又發(fā)現(xiàn)，在 B-CLL細(xì)胞中 miR-15a和miR-16a的表達(dá)與Bcl-2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，實(shí)驗(yàn)證明它們直接與bcl-2 mRNA的3'端UTR序列相互作用調(diào)控Bcl-2蛋白的表達(dá)。Bcl-2蛋白是一種通過作用于線粒體來抑制細(xì)胞凋亡的蛋白，能夠使腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞凋亡。因此推測(cè)，miR-15a和miR-16a對(duì)bcl-2的抑制誘導(dǎo)了白血病細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮了類似抑癌基因的作用［6］。

1.1.2 miR-29 b和 miR-181 b T細(xì)胞白血病 －1(TCL1)基因也是一個(gè)原癌基因，位于染色體14q32.1處，該基因可以作為Akt癌蛋白的輔激活因子增強(qiáng)Akt激酶(也稱蛋白激酶B，PKB)的活性，而Akt癌蛋白則是T細(xì)胞和B細(xì)胞抗凋亡信號(hào)傳導(dǎo)中一個(gè)重要的分子［7］。TCL1在T細(xì)胞白血病和淋巴瘤中常發(fā)生重排，而且過表達(dá)的TCL1可能參與了CLL的形成［8］。研究表明在CLL中 miR-29b和miR-181b因調(diào)控癌基因TCL1而表現(xiàn)出其抑癌基因的特性［9］。

1.1.3 miR-221 和 miR-222 miR-221、miR-222 的靶基因是原癌基因c-kit。Nadia等［10］指出miR-221和miR-222的致癌機(jī)制可能是與miR-221、miR-222結(jié)合的kit的3'端UTR結(jié)合區(qū)域關(guān)鍵部位出現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性(3169 G→A)，從而導(dǎo)致kit轉(zhuǎn)錄下降和Kit蛋白水平低下，抑制正常紅細(xì)胞生成及紅白血病細(xì)胞的增殖，引起急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)的發(fā)生，起到了抑癌基因的作用［11］。

1.2 miRNA具有癌基因的功能

1.2.1 miR-155 人類BIC基因是已知的癌基因之一，在BIC基因上具有一段138個(gè)核苷酸的保守序列，即編碼miR-155的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄因子PU.1 mRNA是B細(xì)胞的分化過程中所必需的，其可能是miR-155的靶基因［12］，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn) PU.1 mRNA的3'端非編碼區(qū)(3'UTR)存在類似miR-155的靶序列。miR-155另一個(gè)可能的靶基因是ICOSL［13］，ICOSL在 T細(xì)胞活化、增殖中發(fā)揮重要作用，其缺乏可能會(huì)影響機(jī)體的免疫反應(yīng)［14］。miR-155水平在兒童Burkitt淋巴瘤、Hodgkin淋巴瘤及彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)等腫瘤中均有提高。miR-155也與Myc在B細(xì)胞中的高表達(dá)有關(guān)，Myc是一個(gè)通過調(diào)控細(xì)胞增殖和死亡，從而調(diào)控細(xì)胞生長的轉(zhuǎn)錄因子［15］。因此，miR-155可能是作為一個(gè)癌基因和Myc協(xié)同作用，而其正常功能是在 B細(xì)胞的分化中起作用［16］。

1.2.2 miR-17－92簇 MiR-17－92簇由 7種miRNA(miR-17 －5p、miR-17 －3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b－1和 miR-92－1)組成，位于13q31.3的 Cl3orf25 的內(nèi)含子。He等［17］比較了正常組織和B細(xì)胞淋巴瘤樣本，發(fā)現(xiàn)從miR-17－92位點(diǎn)衍生出來的前體和成熟miRNA在癌細(xì)胞中大量增加，miRNA作為癌基因調(diào)節(jié)腫瘤的形成。在隨后的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，miR-17－19b－1具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的能力。通過生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-17－92簇中的miR-17－5p和miR-20a成員，以轉(zhuǎn)錄因子E2F1為靶目標(biāo)。E2F1是通過調(diào)節(jié)與DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂和凋亡相關(guān)的基因來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)變［18］。Myc可以誘導(dǎo)E2F1和miR-17－92的轉(zhuǎn)錄，而miR-17－5p和miR-20a可以抑制E2F1的翻譯。在Myc存在的情況下，miR-17－92基因簇中的miRNA限制了E2F1的活性，通過阻斷Myc和E2F1的正反饋循環(huán)削弱了Myc對(duì)于細(xì)胞增殖的影響。此時(shí)，miR-17－92基因簇所起的作用是抑癌基因的作用，這與He等的發(fā)現(xiàn)相反。然而，當(dāng)E2F1的表達(dá)水平超過一閾值，它也可以引起細(xì)胞凋亡，在此情況下，miRNA對(duì)于E2F1的負(fù)調(diào)控可能是通過阻斷E2F1的誘導(dǎo)凋亡活性，促進(jìn)Myc介導(dǎo)的細(xì)胞增殖，又支持了He等提出的模型［19］。

1.2.3 miR-106－363簇 在小兒和成人初診急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)中，大約分別有15%和25%患者是T細(xì)胞ALL(TALL)，而T-ALL與患者的預(yù)后不良有關(guān)。Landais等的研究表明，由 miR-106a，miR-18b，miR-20b，miR-19b－2，miR-92－2和miR-363等6個(gè)miRNA組成的miR-106－363簇在46%的T細(xì)胞白血病中高表達(dá)并可能起著原癌基因的作用［20］。

1.2.4 miR-142與miR-21 在侵襲性B細(xì)胞白血病(aggressive B-cell leukemia)中，常有t(8;17)號(hào)染色體的異位，miR-142基因正好位于這個(gè)區(qū)域。異位的結(jié)果是miR-142基因與截短的c-Myc基因形成融合基因，導(dǎo)致c-Myc在miR-142基因啟動(dòng)子控制下高表達(dá)［21］，促使低度惡性的慢性淋巴瘤演變?yōu)楦叨葠盒缘腂細(xì)胞性白血病。MiR-21位于染色體脆性區(qū)域17q23.2，是一個(gè)發(fā)現(xiàn)較早且備受關(guān)注的miRNA分子，在多種腫瘤中表達(dá)異常，miR-21可以通過抑制PTEN表達(dá)，激活PI3K/AKT信號(hào)通路使白血病K562細(xì)胞系產(chǎn)生對(duì)道諾霉素的耐受性［22］。道諾霉素是一種用于白血病治療的蒽環(huán)霉素化療制劑。產(chǎn)生耐藥性是腫瘤化療的一大障礙，從分子水平上認(rèn)識(shí)耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制有助于探索出更好的治療腫瘤的方法。

2 miRNA的相關(guān)研究方法

檢測(cè)miRNA最常用和直接的方法是Northern雜交、基因芯片技術(shù)、定量PCR、熒光素報(bào)告分析(luciferase reporter assay)和MiRNAs靶基因預(yù)測(cè)技術(shù)。Northern印跡是經(jīng)典的探針雜交檢測(cè)法，從miRNAs發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在，它一直被用于miRNAs的定性研究，若結(jié)合使用miRNAs標(biāo)記(miRNAs marker)也可用于miRNAs的半定量分析。miRNA基因芯片技術(shù)具有高通量的優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的快速檢測(cè)miRNA表達(dá)圖譜的方法。定量PCR(quantitative PCR，qPCR)是對(duì)miRNAs進(jìn)行定量研究的方法，故與前兩種miRNAs檢測(cè)方法相比，靈敏度明顯提高。但是因?yàn)槌墒靘iRNAs分子很短、且沒有poly(A)尾巴，無法按常規(guī)方法設(shè)計(jì)隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，所以通常先用poly(A)聚合酶直接使miRNAs的3'端加上一段 poly(A)尾巴，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。熒光素報(bào)告分析不同于以上三種方法，它主要用于檢測(cè)miRNAs與靶基因相互作用的機(jī)制，一般用于已知 mRNA 3'-UTR確實(shí)存在相應(yīng)miRNAs潛在結(jié)合位點(diǎn)的情況。基本方法是將熒光素酶分別連于mRNA 3'-UTR片段和突變3'-UTR片段下游，然后導(dǎo)入相應(yīng)miRNAs，通過檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱鑒別miRNAs是否通過與mRNA 3'-UTR結(jié)合來發(fā)揮作用［23］。MiRNAs靶基因預(yù)測(cè)可以用于尋找未知的miRNAs結(jié)合位點(diǎn)。因?yàn)閙iRNA與mRNA的相互作用是一個(gè)十分復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，一種miRNA可以作用于多種mRNAs，一種mRNA又同時(shí)受多種miRNAs協(xié)同調(diào)控，所以目前已知的miRNA-mRNA模塊不能涵蓋所有可能的結(jié)合情況，而miRNAs靶基因預(yù)測(cè)技術(shù)可以通過對(duì)可能存在相互作用的miRNAs和mRNAs進(jìn)行微陣列表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)miRNAs新的靶位，從而擴(kuò)充miRNA-mRNA模塊，故有廣泛的應(yīng)用價(jià)值［24］。

3 miRNA與疾病的診斷和治療

miRNA在不同腫瘤中具有特定的表達(dá)模式，這為腫瘤基因診斷開拓了一條新思路。通過對(duì)人不同癌組織中miRNA表達(dá)譜與正常組織表達(dá)譜的對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)各種腫瘤各自特定的miRNA表達(dá)水平均發(fā)生了變化。Calin等［25］采用基因芯片分析慢性B細(xì)胞淋巴瘤與正常B細(xì)胞中miRNA表達(dá)譜的差異，該定量分析技術(shù)可作為慢性B細(xì)胞淋巴瘤有效的新型診斷方法。

腫瘤的發(fā)生可能由兩方面因素引起:一方面，可能由于某些特定的miRNA低表達(dá)或不表達(dá)，因此可采用基因治療的方法，導(dǎo)入相應(yīng)的外源miRNA;另一方面，可能由于某些特定的miRNA高表達(dá)，因此可采用多種方法下調(diào)或抑制相應(yīng)miRNA的表達(dá)。如果miRNA作為癌基因發(fā)揮功能，則可以設(shè)計(jì)與miRNA互補(bǔ)的反義寡核苷酸(AMOs)，使其與miRNA結(jié)合，通過競爭性抑制miRNA與靶mRNA的結(jié)合，而抑制miRNA的功能，降低miRNA過表達(dá)所帶來的負(fù)面效應(yīng)［26］。如果miRNA作為抑癌基因發(fā)揮功能，則可以加入人造miRNA以抵制不足和抑制惡性腫瘤的生長。利用病毒或者脂質(zhì)體的表達(dá)系統(tǒng)可以瞬時(shí)引入大量miRNA。這些技術(shù)可以保證在某些組織特異性的啟動(dòng)子控制之下，表達(dá)pre-miRNA及其兩側(cè)序列，并且刺激內(nèi)源性的miRNA加工，產(chǎn)生正確的miRNA，抑制特定基因表達(dá)。然而這一方法僅在細(xì)胞培養(yǎng)中有所嘗試，仍需要進(jìn)一步在動(dòng)物模型中檢測(cè)［27］。

雖然目前miRNA在多種癌癥中的研究已經(jīng)取得了一些成果，但其參與白血病的致病機(jī)制并沒有完全了解，這些問題仍然需要更加深入地研究。

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