KAI-1轉(zhuǎn)移抑制基因在裸鼠腎癌轉(zhuǎn)移中的意義

杜寧克 潘東亮 晉連超 那彥群

（1.北京市門頭溝區(qū)中醫(yī)院外科，北京102300；2.北京大學(xué)吳階平泌尿外科醫(yī)學(xué)中心，北京大學(xué)首鋼醫(yī)院泌尿外科，北京100144）

KAI-1基因是一個具有2.4kb的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，編碼白細(xì)胞表面糖蛋白，主要參與調(diào)控細(xì)胞粘附，通過使腫瘤細(xì)胞不易脫離原發(fā)灶而抑制轉(zhuǎn)移。它在人類多種正常組織中表達(dá)，特別以前列腺、腎、肝、肺、骨髓和胎盤表達(dá)最高，而且研究顯示KAI-1低表達(dá)與前列腺癌轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[1]。本課題組已通過回顧性分析發(fā)現(xiàn)T1-3aN0M0腎癌術(shù)后轉(zhuǎn)移的發(fā)生與KAI-1表達(dá)缺失顯著相關(guān)，提示KAI-1基因缺失可能參與了T1-3aN0M0腎癌術(shù)后轉(zhuǎn)移[2]。本課題組于2010年6月～2011年1月通過動物實驗進(jìn)一步驗證KAI-1在抑制腎癌轉(zhuǎn)移方面的作用。

1 資料與方法

1.1 腎癌標(biāo)本和實驗動物

1例手術(shù)所取的新鮮腎癌標(biāo)本，通過免疫組織化學(xué)和多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）方法證實為KAI-1表達(dá)陰性。BALB/nu裸鼠80只由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物所提供，鼠齡4～5周，體重19～22g，雌雄兼用（飼養(yǎng)和接種在SPF條件下的超凈層流架中）。

1.2 主要試劑

培養(yǎng)基MEM（Gibico公司）、CMF-Hanks BSS、胎牛血清、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物、Taq酶、dNTP、RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、PCR緩沖液、質(zhì)粒和脂質(zhì)體均購自Promega公司。KAI-1一抗（sc-17752，鼠抗人）購自美國Santa Cruz公司，二抗（PV6002，山羊抗鼠）購自美國PowerVision公司。RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司。RPMI-1640和胎牛血清購自北京中山試劑公司。

1.3 免疫組織化學(xué)方法（IHC）和多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）驗證腎癌組織KAI-1的表達(dá)

1.3.1 IHC采用Powe r Vision二步法檢測KAI-1的表達(dá)

將石蠟包埋的組織塊切片，厚度為4μm；微波、0.1%胰酶各修復(fù)10min；滴加一抗過夜；滴加二抗15min；DAB顯色；二甲苯透明，中性樹膠封片；光鏡觀察。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：用已知陽性片作陽性對照，用緩沖液代替一抗作陰性對照。以細(xì)胞漿、膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為KAI-1陽性染色的判斷標(biāo)準(zhǔn)。高倍鏡（×400）下選擇10個有代表性的視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞百分比。腫瘤細(xì)胞相應(yīng)部位不著色或陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為陰性（0）；5%～50%為弱陽性（1+）；＞50%為強(qiáng)陽性（2+）。

1.3.2 PCR步驟 自Genbank查出KAI-1 cDNA序列，設(shè)計引物，擴(kuò)增片斷自cDNA的第168位堿基至300位，片斷長度為798bp。引物序列如下：正義5'CAAGATCTATGGGCTCAGCCTGTATCAAAGTCACC3'，反義5'CCAAGCTTTCAGTACTTGGGGACCTTGCTGTAGTC3'；設(shè)計β-actin內(nèi)參照引物1對，擴(kuò)增片斷長度為776bp，引物序列如下：正義5'CTATTGGCAACGAGCGGTTC 3'；反義5'CTTAGGAGTGGGGGTGGCTT3'，以上引物均由美國Santa Cruz公司提供。組織總RNA抽提按RNA抽提試劑盒的說明進(jìn)行。凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量，紫外分光光度計測定RNA含量。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增與電泳，紫外燈下觀察記錄照相。

1.4 腎癌細(xì)胞懸液制備

將所取腎癌組織用PBS洗滌；在培養(yǎng)皿內(nèi)將腎癌組織用刀切成1～2mm3的小塊，用CMF-Hanks BSS洗滌；將組織小塊轉(zhuǎn)移到離心試管中，加入CMF-Hanks BSS，晃動10min；吸去CMF-Hanks BSS后，加入0.25%胰酶消化液。封管后置37℃下消化45min；收集細(xì)胞懸液，置4℃冰箱內(nèi)冷卻，在所余組織上再一次加入胰酶，重復(fù)上述的消化過程，將收集的細(xì)胞懸液與已冷卻的細(xì)胞懸液混合，重復(fù)此步驟10次；將細(xì)胞懸液用不銹鋼網(wǎng)篩過濾，收集濾過液；對濾過液離心，轉(zhuǎn)速1000r/min，離心10min；棄去上清液，將細(xì)胞沉淀用少量培養(yǎng)液重新懸?。挥醚?xì)胞計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞密度，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL；待接種。

1.5 脂質(zhì)體介導(dǎo)KAI-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染KAI-1陰性腎癌細(xì)胞

將上述KAI-1陰性腎癌細(xì)胞傳代培養(yǎng)穩(wěn)定后，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)KAI-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染KAI-1陰性腎癌細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染成功后KAI-1陽性細(xì)胞培養(yǎng)傳代。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL；待接種。

1.6 裸鼠皮下成瘤接種實驗

將裸鼠分成兩組，各40只。每只裸鼠右后肢皮下接種0.2mL含106個細(xì)胞的懸液。一組接種腎癌KAI-1表達(dá)陽性細(xì)胞懸液；另一組接種腎癌KAI-1表達(dá)陰性細(xì)胞懸液。觀察裸鼠接種腫瘤生長情況，1～6周每周測量瘤體長徑（a）和短徑（b），計算腫瘤體積（V），V＝a×b2/2和腫瘤生長率（tumor growth rate，TGR），TGR＝（V（第n+1周）/V（第n周））×100%。接種后6周處死裸鼠，取皮下實體腫瘤和肺臟，并將皮下腫瘤稱重。

1.7 肺部轉(zhuǎn)移瘤計數(shù)

取鼠肺臟，在顯微鏡下（×40）計數(shù)肺表面結(jié)節(jié)數(shù)量。

1.8 IHC和PCR檢測原腎癌標(biāo)本、鼠皮下接種瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤KAI-1表達(dá)

以上述方法3中的IHC和PCR步驟檢測每只裸鼠皮下接種瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤及其原腎癌標(biāo)本的KAI-1表達(dá)，比較KAI-1在接種、成瘤和轉(zhuǎn)移過程中的穩(wěn)定性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析；計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示，采用t檢驗，計數(shù)資料用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠皮下成瘤實驗

80只裸鼠接種成瘤均獲成活，近1周末時均在接種部位可觸及皮下腫瘤。所有裸鼠腫瘤增長迅速，以接種后2～3周最為明顯。6周時捫及直徑1～2cm大小的塊狀實性腫物。每周接種瘤平均數(shù)據(jù)見表1。6周末處死裸鼠，解剖發(fā)現(xiàn)裸鼠體內(nèi)成瘤率均為100%。

表1 裸鼠皮下接種瘤生長速度及體積（±s）

表1 裸鼠皮下接種瘤生長速度及體積（±s）

周a（mm） b（mm） V（mm3） TGR（%）1 1.07±0.32 0.78±0.15 0.34±0.12 -2 2.51±0.79 2.18±0.50 6.04±0.89 1776.4 3 4.61±0.97 4.17±0.62 40.56±8.33 671.5 4 6.44±1.31 5.97±1.14 115.10±9.45 283.8 5 8.35±2.23 7.80±1.92 252.47±23.94 219.3 6 9.45±2.77 9.17±2.34 393.35±45.71 115.8

2.2 肺臟表面結(jié)節(jié)數(shù)量

KAI-1表達(dá)陽性組：成瘤腫物1.58～2.53g，平均2.16g。38只裸鼠肺臟表面可見直徑1～2mm灰紅色米粒狀結(jié)節(jié)，40只裸鼠結(jié)節(jié)數(shù)量0～11個，平均6個。KAI-1表達(dá)陰性組：成瘤腫物1.34～2.79g，平均2.32g。39只裸鼠肺臟表面可見直徑1～2mm灰紅色米粒狀結(jié)節(jié)，40只裸鼠結(jié)節(jié)數(shù)量0～57個，平均31個。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，兩組肺臟結(jié)節(jié)數(shù)量比較χ2＝5.01，P＜0.05。

2.3 IHC和PCR對接種瘤、肺轉(zhuǎn)移瘤和原腎癌標(biāo)本的檢測

鏡下見皮下接種瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤呈實性結(jié)構(gòu)，瘤細(xì)胞分布密集、雜亂，大小不一，核分裂相多見，胞漿呈透明狀。經(jīng)IHC（圖1）和PCR（圖2）檢測，每只裸鼠接種瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤的KAI-1表達(dá)均與原腎癌標(biāo)本一致。

圖1 KAI-1表達(dá)陽性腎細(xì)胞癌肺轉(zhuǎn)移瘤KAI-1免疫組織化學(xué)染色（2+）（×200）

圖2 RT-PCR檢測腎癌中KAI-1基因陽性表達(dá)：表現(xiàn)為約800bp處特異核酸片斷條帶

3 討論

盡管有關(guān)腎癌轉(zhuǎn)移研究成果的報道不斷增多，但其轉(zhuǎn)移機(jī)理仍未明確。例如，VHL腫瘤抑制基因的失活可導(dǎo)致腫瘤血管內(nèi)皮生長因子過度生成，促進(jìn)腫瘤血管形成和腎癌的轉(zhuǎn)移[3]；VHL基因的丟失通過低氧誘導(dǎo)因子途經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)CUB域包含蛋白1信號給PKCδ，激活并增加腎癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[4]。其他研究顯示，CD151高表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的高期高核級別相關(guān)[5]；Forkhead轉(zhuǎn)錄因子1與腎癌細(xì)胞級別和Ki67表達(dá)相關(guān)[6]；Glutathione S轉(zhuǎn)化酶是一種高度特異性的預(yù)測腎癌進(jìn)展和預(yù)后的標(biāo)記物[7]。VHL腫瘤抑制基因、MET原癌基因、TFE3轉(zhuǎn)錄因子癌蛋白等多種因素及途徑共同參與了腎癌的進(jìn)展[8]。男性腎癌具有更高的臨床分期和診斷時更高的轉(zhuǎn)移發(fā)生率、更低的腫瘤特異性存活率，但是性別仍不是獨立的預(yù)后指標(biāo)[9]。這進(jìn)一步豐富了腎癌轉(zhuǎn)移機(jī)理，但是仍不能為臨床工作提供直接、確切、實用的標(biāo)記物。

KAI-1氨基酸序列的保守性可使鼠實驗結(jié)果對人類具有高度提示意義。KAI-1基因翻譯出的蛋白質(zhì)與已發(fā)現(xiàn)的CD82結(jié)構(gòu)相同，是TM4SF（transmembrane 4 superfamily）或TST（tetra spans transmembrane）家族成員。CD82的氨基酸序列在人、猴、狗、兔、牛與大、小鼠中相當(dāng)保守[10]。因此，在裸鼠體內(nèi)研究所得KAI-1轉(zhuǎn)移抑制基因表達(dá)與腎癌轉(zhuǎn)移關(guān)系的結(jié)果對人類也具有重要的提示意義。本研究選用的兩種腎癌細(xì)胞株具有同一來源，基因組中僅有KAI-1全或無的差別；而且在實驗中反復(fù)通過免疫組織化學(xué)和PCR方法進(jìn)行測試排除了KAI-1發(fā)生突變的可能性，所以保證了實驗結(jié)果的科學(xué)性和可靠性。

KAI-1表達(dá)缺失組裸鼠肺臟表面轉(zhuǎn)移灶數(shù)量增多。本實驗中KAI-1表達(dá)陽性組裸鼠肺臟表面的轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量為0～11個，平均6個；KAI-1表達(dá)陰性組轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量為0～57個，平均31個；兩者數(shù)量比較具有統(tǒng)計學(xué)意義，證實了KAI-1表達(dá)缺失促進(jìn)了腎癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，為臨床檢測KAI-1表達(dá)預(yù)測腎癌轉(zhuǎn)移提供了可靠的實驗依據(jù)。另外本實驗發(fā)現(xiàn)，在裸鼠皮下的成瘤實驗6周內(nèi)中出現(xiàn)了肺臟轉(zhuǎn)移瘤，提示腎癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的時間可能較早，只是最早發(fā)生轉(zhuǎn)移的時間以及與原發(fā)瘤大小的關(guān)系尚缺乏研究。本實驗還顯示，即使KAI-1表達(dá)陽性組腎癌也有轉(zhuǎn)移瘤，只是與KAI-1表達(dá)陰性組相比數(shù)量較少，說明KAI-1基因不是決定腎癌轉(zhuǎn)移的唯一因素。

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