茶渣多肽制備及其對羥自由基的清除能力

羅紅玉，郁 軍，岳鵬翔，陳 暄，王麗璞，黎星輝,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所，江蘇 南京 210095；2.大閩食品(漳州)有限公司博士后科研工作站，福建 漳州 363000)

茶渣多肽制備及其對羥自由基的清除能力

羅紅玉1,2，郁 軍2，岳鵬翔2，陳 暄1，王麗璞1,2，黎星輝1,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所，江蘇 南京 210095；2.大閩食品(漳州)有限公司博士后科研工作站，福建 漳州 363000)

分別以酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶以及復(fù)合蛋白酶水解茶渣粗蛋白制備茶渣多肽，并對多肽的羥自由基清除能力進(jìn)行考察。通過單因素試驗證明：復(fù)合蛋白酶的效果最好，其最佳水解工藝條件為粗蛋白液質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、加酶量600U/g、溫度55℃、pH8.0、水解5h，在此條件下，多肽對羥自由基的清除能力達(dá)27.3%；堿性蛋白酶的效果也較好，其最佳工藝為蛋白液質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、加酶量400DU/g、pH8.5、溫度50℃、時間1.0h，在此條件下，多肽對羥自由基的清除能力達(dá)25.3%，與前者的清除能力沒有顯著差異，但用時少4h；利用堿性蛋白酶作為酶源制得茶渣多肽粗品中含有蛋白質(zhì)、多肽、游離氨基酸分別為28.4%、11.0%、1.5%，其對羥自由基的半清除率IC50為8.432mg/mL，相同條件下VC的IC50為0.897mg/mL。

茶渣蛋白；蛋白酶；水解；多肽；羥自由基

在正常的生理代謝過程中，人體會產(chǎn)生自由基，如超氧陰離子自由基、羥自由基等。過多的自由基會直接氧化破壞蛋白質(zhì)，從而損傷組織、細(xì)胞以及DNA[1-2]。多肽是一類由氨基酸構(gòu)成但又不同于蛋白質(zhì)而具有蛋白質(zhì)特性的中間產(chǎn)物。具有抗氧化性的多肽被稱為抗氧化活性肽，是生物活性肽的一種，通過減少自由基以及抑制脂質(zhì)過氧化從而達(dá)到抗氧化作用[3-4]。作為基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)，活性肽比蛋白質(zhì)更易吸收，生物利用度更高；同時，部分活性肽具有調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能的功效。這些特性往往是蛋白及游離氨基酸所不具備的。

目前，活性肽獲得途徑主要有兩種：一是直接從生物體中提取內(nèi)源活性肽，如肌肽、谷胱甘肽；二是人工合成，可通過酸法水解、酶法水解、發(fā)酵法、重組DNA技術(shù)合成。其中，酶法生產(chǎn)安全性高，條件溫和，可定位生成特定肽，如易吸收肽、抗氧化活性肽、降血壓肽等，該法成本低，已成為活性肽最主要的生產(chǎn)方法?，F(xiàn)已通過酶法獲得多種活性肽，如具有抗氧化活性的大豆多肽[5-7]、花生多肽[8]、玉米多肽[9]以及魔芋多肽[10]以及其他多肽[11]。

研究表明，酶法所得多肽的氨基酸序列、組成及分子質(zhì)量大小共同決定著其抗氧化能力[4,12]。隨著蛋白水解過程的進(jìn)行，水解度逐漸增大，水解產(chǎn)物中蛋白質(zhì)、肽、氨基酸的組成、含量也發(fā)生相應(yīng)的變化。張強(qiáng)等[13]研究報道，隨著水解度的增加，米糠多肽的抗氧化活性逐步增強(qiáng)。但在陳力宏等[14]對蠶繭層抗氧化肽的研究中，水解液的抗氧化活性未隨水解度的增加而增加。由于不同蛋白質(zhì)具有不同的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，因此要獲得具有較好抗氧化活性的多肽，其合適的水解度需要通過具體實驗才能確定。

張紅城等[15]研究表明，茶花花粉多肽具有很強(qiáng)的抗氧化能力。龔吉軍等[16]報道，茶籽多肽對超氧陰離子自由基和羥自由基具有強(qiáng)烈的清除作用。王洪新等[17]通過酸-鹽法提取茶粗蛋白，并經(jīng)丙酮脫色、超濾脫鹽后所得的產(chǎn)品能清除超氧陰離子自由基。茶葉中含有20%～30%的蛋白質(zhì)，其中大部分由于不溶于水而殘留于茶渣中。茶渣主要被用作飼料、肥料，更多被自由排放，不僅浪費資源還造成環(huán)境污染。目前，對其中的蛋白質(zhì)研究主要集中在初步提取純化及理化性質(zhì)改性階段[18]，對具有抗氧化活性的茶渣多肽研究未見報道。本實驗采用酶法水解茶渣蛋白制備茶渣多肽，以所得多肽對羥自由基的清除能力為指標(biāo)，對不同的蛋白酶進(jìn)行篩選，旨在為制備抗氧化茶渣多肽尋找合適的酶源和工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純度為41.0%的茶渣粗蛋白粉 實驗室自制；Protex 6L堿性蛋白酶(最適pH9.5、最適溫度60℃、酶比活力58000DU/g) 無錫杰能科生物工程有限公司；Protease M“Amano”G酸性蛋白酶(最適pH4.5、最適溫度50℃、酶比活力5500U/g)、Protease A“Amano”2G中性蛋白酶(最適pH7.0、最適溫度50℃、酶比活力20000U/g)、ProteAX復(fù)合蛋白酶(最適pH7.0、最適溫度60℃～70℃、酶比活力1250U/g) 日本天野酶制品株式會社；硫酸、氫氧化鈉、定氮催化劑、硼酸、鹽酸、水楊酸、七水合硫酸亞鐵、無水乙醇、30%過氧化氫和三氯乙酸(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

PL 203電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；pHS-3 C pH計 上海精科實業(yè)有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市江南儀器廠；TU-1800S紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RJTDL-5A低速臺式大容量離心機(jī) 無錫市瑞江分析儀器有限公司；KDN-08定氮裝置 上海新嘉電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)、游離氨基酸的測定

蛋白質(zhì)：GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》；游離氨基酸：GB/T 8314—2002《茶：游離氨基酸總量測定》。

1.3.2 多肽的制備

定量稱取蛋白酶制品，加入少許蒸餾水于其最適溫度下預(yù)熱5min，再加入到已配制好的茶渣粗蛋白水溶液中，調(diào)節(jié)混合液pH值，并于相應(yīng)溫度下水解一定時間(密閉條件下，每10min攪拌1次)，水解完后于100℃加熱5min鈍化酶活性，水解液經(jīng)濃縮再冷凍干燥即得茶渣多肽粗品。

1.3.3 蛋白酶的水解

酸性蛋白酶、中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶，在各自最適溫度和pH值條件下，以1000U/g粗蛋白的加酶量加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的粗蛋白水溶液中酶解5h，堿性蛋白酶在其最適條件下加酶量為400DU/g粗蛋白，水解3h。酶解完成后在100℃加熱5min鈍化酶活性，定溶至50mL，備測。

1.3.4 對羥自由基的清除能力測定

采用水楊酸法[19-21]。經(jīng)優(yōu)化后的方法為：在10mL的比色管中依次加入0.5mL 10mmol/L水楊酸-乙醇溶液、0.5mL 10mmol/L 七水合硫酸亞鐵溶液、0.5mL 3.0mg/mL樣液(控制pH7.0)、8mL蒸餾水，最后加入0.5mL 10mmol/L H2O2啟動Fenton反應(yīng)，搖勻后于室溫靜置20min，以蒸餾水作為參比于510nm處測定其吸光度。羥自由基清除能力計算公式如下：

式中：C為多肽對羥自由基的清除能力；A1為加入樣液后的吸光度；A2為以蒸餾水替代水楊酸后的吸光度；A3為以蒸餾水替代樣液的吸光度。樣品對羥自由基的半數(shù)清除濃度IC50計算方法為：制作濃度-清除能力曲線，建立線性回歸方程，根據(jù)方程求得IC50。

1.3.5 酶解工藝條件優(yōu)化

采用單因素試驗法對復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶的水解條件進(jìn)行優(yōu)化。在復(fù)合蛋白酶水解過程中，控制基本條件為粗蛋白液質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，加酶量500U/g粗蛋白，溫度65℃，pH7.0，水解3h，分別研究粗蛋白液質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.5%、0.8%、1.1%、1.4%、1.7%)、加酶量(100、200、300、400、500、600、700、800、900U/g粗蛋白)、酶解溫度(35、45、55、65、75℃)、酶解pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、酶解時間(1、2、3、4、5h)對多肽清除羥自由基能力的影響。

在堿性蛋白酶水解過程中，控制基本條件為粗蛋白液質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，加酶量400DU/g，溫度60℃，pH9.5，水解3h，分別考察粗蛋白液質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.5%、0.8%、1.1%、1.4%、1.7%)、加酶量(100、200、400、800、1200、1600DU/g粗蛋白)、酶解溫度(30、40、50、60、70)、 酶解pH值(7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5)、酶解時間(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0h)對多肽清除羥自由基能力的影響。

1.3.6 多肽粗品組成成分分析

多肽、水解度測定采用TCA法[22]。吸取40mL樣液，加入10% TCA溶液10mL，搖勻靜置10min，將溶液定量轉(zhuǎn)移，4000r/min離心10min，取20mL上清液，按蛋白質(zhì)含量測定法測定含氮量。

所得多肽中蛋白質(zhì)含量/%= (粗蛋白中總氮含量-酶解后氨基態(tài)氮含量)×6.25×100

多肽/%=(酶解液中氨基態(tài)氮含量-酶解液中游離氨基酸含量) ×6.25×100

式中：N0為茶渣粗蛋白酶解前總氮含量；N1為茶渣粗蛋白酶解前氨基態(tài)氮含量；N2為茶渣粗蛋白酶解后氨基態(tài)氮含量。

1.3.7 統(tǒng)計方法

試驗采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

表1 不同蛋白酶水解產(chǎn)物對羥自由基清除能力的比較Table 1 Scavenging capacity of different protease hydrolysates against hydroxyl free radicals

由表1可知，粗蛋白本身對羥自由基具有一定的清除能力，一是因為蛋白可具有一定抗氧化性，另與茶渣粗蛋白中含有多酚、多肽以及抗氧化酶，如氧化氫酶有關(guān)；當(dāng)加入蛋白酶水解后，所得產(chǎn)物對羥自由基的清除能力明顯增強(qiáng)；但不同的蛋白酶所得產(chǎn)物清除能力不同，這與不同蛋白酶與蛋白的作用位點不同有關(guān)，所得多肽的N末端、C末端氨基酸組成、以及排序、分子質(zhì)量大小也存在差異，產(chǎn)物的構(gòu)象也有所不同，因此表現(xiàn)出水解產(chǎn)物清除自由基能力的差異。其中復(fù)合蛋白酶水解物能力最強(qiáng)為16.9%，中性蛋白酶水解物能力最弱為9.8%。因此，試驗初步確定以復(fù)合蛋白酶為最佳酶選。

2.2 酶解條件的優(yōu)化

由于堿性蛋白酶的比活力單位不同于其他酶類，在2.1節(jié)基礎(chǔ)上，選擇復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶水解茶渣蛋白制備多肽，通過單因素試驗以其產(chǎn)物的羥自由基清除能力為測定指標(biāo)進(jìn)行水解條件的優(yōu)化。

2.2.1 粗蛋白液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對羥自由基清除能力的影響

圖1 蛋白液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對羥自由基清除能力的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on hydroxyl free radical scavenging activity

從圖1可知，在一定范圍內(nèi)，隨著粗蛋白液質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，清除羥自由基能力變化很小，說明蛋白液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對水解過程無明顯影響；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時，能力相對較高，復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶所得多肽對羥自由基的清除能力分別為23.6%、26.3%；因此試驗確定粗蛋白的合適質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%。

2.2.2 蛋白酶加量對羥自由基清除能力的影響

圖2 加酶量對羥自由基清除能力的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on hydroxyl free radical scavenging activity

由圖2可知，隨著酶量的增加，多肽對羥自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)再減弱最后趨于穩(wěn)定，因為隨著酶量增加，酶與蛋白結(jié)合的程度也增加，從而蛋白水解度增加，由此產(chǎn)生更短肽段，由于肽段的氨基酸排序和分子量大小不同從而影響著多肽的清除能力，說明當(dāng)水解程度較低時，多肽對羥自由基的清除能力會隨著水解度的增加而增加。當(dāng)粗蛋白中復(fù)合蛋白酶加量為600U/g時，產(chǎn)物清除羥自由基能力最大為29.3%；當(dāng)堿性蛋白酶加量為400DU/g時，清除能力為24.7%，與加量為800DU/g時的清除能力25.0%無顯著差異；因此試驗確定粗蛋白中復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶的最適加量分別為600U/g、400DU/g。

2.2.3 溫度對羥自由基清除能力的影響

圖3 溫度對羥自由基清除能力的影響圖Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on hydroxyl free radical scavenging activity

由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，多肽對羥自由基的清除能力先增強(qiáng)再減弱，一是因為溫度對對蛋白酶活的影響，當(dāng)溫度較低時，蛋白酶活性會隨著溫度升高而增強(qiáng)，當(dāng)溫度過高時，會使酶失活，二是高溫會引起蛋白自身水解，三是因為高溫會使多肽變性失活。當(dāng)溫度為55℃時，復(fù)合蛋白酶所得多肽的清除能力最強(qiáng)為25.6%，當(dāng)溫度為50℃時，堿性蛋白酶所得多肽的清除能力最強(qiáng)為24.4%。因此，試驗確定復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶的最佳水解溫度分別為55、50℃。

2.2.4 pH值對羥自由基清除能力的影響

圖4 pH值對羥自由基清除能力的影響Fig.4 Effect of pH on hydroxyl free radical scavenging activity

由圖4可知，在復(fù)合蛋白酶水解過程中，在一定pH值范圍內(nèi)，所得多肽對羥自由基的清除能力隨著pH的增加緩慢增強(qiáng)，說明較高pH值可以激活該蛋白酶，使粗蛋白進(jìn)一步水解；當(dāng)pH8.0時，多肽的清除能力達(dá)最高即24.3%。在堿性蛋白酶水解過程中，所得多肽的清除能力隨著pH值增加呈先增強(qiáng)再減弱最后又增強(qiáng)的趨勢，當(dāng)pH8.5時，多肽的清除能力最強(qiáng)為26.0%。因此，試驗確定兩種蛋白酶的最佳水解pH值分別為8.0、8.5。

2.2.5 水解時間對羥自由基清除能力的影響

圖5 水解時間對羥自由基清除能力的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on hydroxyl free radical scavenging activity

由圖5可知，在復(fù)合蛋白酶水解過程中，隨著時間的延長，多肽對羥自由基的清除能力也增強(qiáng)，在堿性蛋白酶水解過程中，多肽的清除能力先增強(qiáng)再逐漸減弱。因為不同的蛋白酶與蛋白的結(jié)合位點不同，所得產(chǎn)物結(jié)構(gòu)也不同；堿性蛋白酶與復(fù)合蛋白酶的酶比活單位不同，因此無法控制兩者加量一致，與復(fù)合蛋白酶相比，當(dāng)加入堿性蛋白酶時，蛋白水解程度相對更大，隨著時間的推進(jìn)，多肽再度分解為分子質(zhì)量更小的小肽和氨基酸，從而使其羥自由基清除能力下降。復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶水解蛋白所得多肽最強(qiáng)的清除能力分別為24.8%、24.5%，水解時間分別為5、1h。因此，試驗確定兩種蛋白酶的最佳水解時間分別為5、1h。

通過單因素試驗可知，采用復(fù)合酶水解茶渣粗蛋白制備抗氧化多肽的最佳工藝為粗蛋白液質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、加酶量600U/g、溫度55℃、pH8.0、水解5h，堿性蛋白酶水解的最佳工藝為粗蛋白液質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、加酶量400DU/g、溫度50℃、pH8.5、水解1h。

2.3 復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶水解產(chǎn)物對羥自由基清除能力的比較

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以各酶最佳工藝條件下比較復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶水解產(chǎn)物對羥自由基清除能力。由表2可知，兩種酶中前者的水解效果略好于后者，經(jīng)t檢驗表明兩者沒有顯著差異，但水解時間卻為后者的5倍。本著經(jīng)濟(jì)原則，試驗確定以堿性蛋白酶作為制備茶渣多肽的合適酶源。

表2 復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶水解產(chǎn)物對羥自由基清除能力的比較Table 2 Comparison of hydroxyl free radical scavenging capacity of crude polypeptide samples obtained by hydrolysis with protamex and alkaline protease

2.4 堿性蛋白酶水解產(chǎn)物多肽粗品與VC對羥自由基清除能力的比較

圖6 多肽粗品和VC對羥自由基清除能力的比較Fig.6 Comparison of hydroxyl free radical scavenging capacity of crude peptide sample obtained by protamex hydrolysis and vitamin C

由圖6可知，多肽的抗氧化能力總體均不及VC；隨著兩者質(zhì)量濃度的增加，抗氧化能力增強(qiáng)；當(dāng)VC質(zhì)量濃度達(dá)到1.97mg/mL時，清除能力已經(jīng)最大為100%，當(dāng)多肽粗品質(zhì)量濃度為6.6mg/mL時，其清除能力為37.2%，仍然有繼續(xù)升高的趨勢；經(jīng)統(tǒng)計分析，當(dāng)清除體系50%的羥自由基時，所需多肽粗品的IC50為8.432mg/mL，而VC的IC50則為0.897mg/mL。

2.5 堿性蛋白酶水解產(chǎn)物多肽粗品組成分析

表3 多肽粗品組成分析Table 3 Contents of protein, polypeptide and free amino acid of crude polypeptide sample obtained by alkaline protease hydrolysis

從表3數(shù)據(jù)可知，純度為41.0%的粗蛋白經(jīng)過蛋白酶水解后所得的多肽粗品中，蛋白含量為28.4%，多肽含量為11.0%，游離氨基酸含量為1.5%，總氨基態(tài)氮含量為12.5%，粗蛋白的水解度為21.8%。

3 結(jié)論與討論

因為堿性蛋白酶的比活單位不同于酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及復(fù)合蛋白酶，試驗首先對其余3種蛋白酶進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)采用復(fù)蛋白酶水解茶渣蛋白所得多肽對羥自由基的清除能力最強(qiáng)為16.9%。再對該酶和堿性蛋白酶的水解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，通過單因素試驗證明：復(fù)合蛋白酶效果較好，其最佳工藝為粗蛋白液質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、加酶量600U/g、溫度55℃、pH8.0、水解5h，在此條件下多肽對羥自由基清除能力達(dá)27.3%；堿性蛋白酶的效果也較好，其最佳水解工藝為蛋白液質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、加酶量400DU/g、pH8.5、溫度50℃、時間1.0h，在此條件下多肽對羥自由基清除能力達(dá)25.3%，經(jīng)統(tǒng)計分析與復(fù)合蛋白酶水解最佳工藝條件下并無差異，但用時卻比復(fù)合蛋白酶少了4h。因此，以堿性蛋白酶作為制備茶渣多肽的合適酶源。以此酶制得的茶渣多肽粗品中，蛋白質(zhì)、多肽和游離氨基酸含量分別為28.4%、11.0%、1.5%。與VC比較結(jié)果顯示：當(dāng)VC質(zhì)量濃度達(dá)到1.97mg/mL時，對羥自由基的清除能力達(dá)最大為100%，當(dāng)多肽粗品質(zhì)量濃度為6.6mg/mL時，其能力為37.2%；兩者抗氧化的IC50值分別為0.897、8.432mg/mL。

蛋白酶對茶渣蛋白的水解主要受加酶量、溫度、pH值、水解時間4個因素的影響。其中，加酶量的增加會促使體系水解速度與程度增大，從而生成不同大小、長短的多肽以及氨基酸；溫度對催化反應(yīng)的影響一方面是對酶活的影響，另一方面是對產(chǎn)物蛋白和多肽的影響，因為高溫會引起蛋白自身水解以及導(dǎo)致多肽變性失活從而影響其清除能力；在水解過程中，pH值不但會影響酶活力，而且還會影響多肽性質(zhì)，由于多肽在不同的pH值下離子狀態(tài)會發(fā)生變化，從而影響其構(gòu)象的穩(wěn)定性；不同蛋白酶最適宜的催化時間不同，而且隨著時間的延長，蛋白質(zhì)的水解度也相應(yīng)增加，從而使多肽進(jìn)一步水解成小肽和氨基酸，最終使得產(chǎn)物對羥自由基的清除能力也逐漸減弱。

試驗中每一種蛋白酶原有的最適催化條件不一定就是實際催化反應(yīng)的最佳條件，蛋白酶最適條件多以水解度為準(zhǔn)，而此時水解產(chǎn)物對羥自由基清除能力并不一定最好，因此試驗中所得各酶最佳參數(shù)與其最適條件并不一致；多肽的氨基酸序列、所暴露的基團(tuán)等直接關(guān)系著其清除自由基的能力，關(guān)于試驗所得多肽粗品對羥自由基的清除機(jī)理還有待深入研究。

[1]SCHYMAN P, ERIKSSON L A, ZHANG R B, et al. Hydroxyl radical -thymine adduct induced DNA damage[J]. Chemical Physics Letters, 2008, 458(1/3)∶ 186-189.

[2]JIN B J, EUL W S, HYUNG J J. Effect of extracts from pine deedle against oxidative DNA damage and apoptosis induced by hydroxyl radical via antioxidatant activity[J]. Food and Chenmical Toxicology, 2009, 47(8)∶ 2135-2141.

[3]吳繼衛(wèi), 何海倫, 路敬濤, 等. 海洋生物蛋白的酶解及酶解產(chǎn)物的抗氧化活性[J]. 海洋科學(xué), 2005, 29(3)∶ 76-80.

[4]周小理, 李紅敏. 植物抗氧化(活性)肽的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè), 2006 (3)∶ 11-13.

[5]KIM H J, BAE I Y, AHN C W, et al. Purification and identification of adipogenesis inhibitory peptide from black soybean protein hydrolysate [J]. Peptides, 2007, 28(11)∶ 2098-2103.

[6]KUBA M, TANA C, TAWATA S, et al. Production of angiotenisin Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptides from soybean protein with Monascus purpureus acid proteinase[J]. Process Biochemical, 2005, 40(6)∶ 2191-2196.

[7]陳湘寧, 張艷艷, 范俊峰, 等. 大豆多肽的凝膠性及抗氧化性研究[J].食品科學(xué), 2005, 26(5)∶ 71-75.

[8]HWANG J Y, SHYU Y S, WANG Y T, et al. Antioxidative properties of protein hydrolysate from defatted peanut kernels treated with esperase [J]. Food Science and Technology, 2010, 43(2)∶ 285-290.

[9]朱艷華, 譚軍. 玉米多肽對大鼠體外抗氧化作用的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(3)∶ 463-465.

[10]王莉, 徐懷德, 王興等. 魔芋多肽的物理特性和抗氧化特性[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2009, 18(4)∶ 218-222.

[11]GUO H, KOUZUMA Y, YONEKURA M. Structures and properties of antioxidative peptides derived from royal jelly protein[J]. Food Chem, 2009, 113(1)∶ 238-245.

[12]張昊, 任發(fā)政. 天然抗氧化肽的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(1)∶443-447.

[13]張強(qiáng), 周正義, 王松華. 從米糠中制備抗氧化肽的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2007, 28(7)∶ 145-147.

[14]陳力宏, 董英, 孫艷輝. 酶法制備蠶繭層抗氧化多肽水解液的研究[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2006, 32(3)∶ 443-444.

[15]張紅城, 李慧巖, 董捷, 等. 茶花花粉蛋白酶解物抗氧化性的研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(8)∶ 58-61.

[16]龔吉軍, 李忠海, 鐘海雁, 等. 茶籽多肽的制備及抗氧化活性研究[J].食品研究與開發(fā), 2007, 28(10)∶ 59-61.

[17]王洪新, 胡昌云. 茶葉蛋白質(zhì)的改性及其功能性質(zhì)研究[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(6)∶ 135-140.

[18]胡曉倩, 楊代群. 茶葉蛋白的研究現(xiàn)狀分析及發(fā)展對策研究[J]. 資源開發(fā)與市場, 2010, 26(1)∶ 4-6.

[19]BENATTI C T, TAVARES C R G, GUEDES T A. Optimization of Fenton,s oxidation of chemical laboratory wastewaters using the response surface methodology[J]. Journal of Environmental Management, 2006, 80(1)∶ 66-74.

[20]丁利君, 周國棟. 蓮子水溶性糖的提取及其對自由基清除能力的研究[J]. 食品科學(xué), 2002, 23(8)∶ 252-254.

[21]JIN B J, BEN O D L, HYUNG J J. Lunasin peptide purified from Solanum nigrum L. protects DNA from oxidative damage by suppressing the generation of hydroxyl radical via blocking fenton reaction[J]. Cancer Letters, 2010, 293(1)∶ 58-64.

[22]宋曉燕, 高彥祥, 袁芳. 響應(yīng)面法優(yōu)化羊胎粉中抗氧化多肽制備工藝的研究[J]. 食品科技, 2008, 33(11)∶ 237-240.

Preparation and Hydroxyl Free Radical Scavenging Activity of Tea Residue Polypeptides

LUO Hong-yu1,2，YU Jun2，YUE Peng-xiang2，CHEN Xuan1，WANG Li-pu1,2，LI Xing-hui1,*
(1. Tea Research Institute, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. The Post-Doctoral Research Station, Damin Food (Zhangzhou) Co. Ltd., Zhangzhou 363000, China)

In order to establish an enzymatic method to hydrolyze crude tea residue protein to prepare tea residue polypeptides with higher hydroxyl free radical scavenging activity, the effects of enzymes (acidic protease, neutral protease, alkaline protease and protamex), substrate concentration, enzyme dosage, temperature, pH, hydrolysis time on hydroxyl free radical scavenging activity were studied. Protamex was the best enzyme for the preparation of tea residue polypeptides with hydroxyl free radical scavenging activity, followed by alkaline protease and the optimal substrate concentration, enzyme dosage, hydrolysis temperature, pH and hydrolysis time were 0.5%, 600 U/g, 55 ℃, 8.0 and 5 h for protamex hydrolysis, and 0.5%, 400 DU/g, 8.5, 50 ℃ and 1.0 h for alkaline protease hydrolysis, resulting in a hydroxyl free radical scavenging rate of 27.3% and 25.3%, respectively. Compared with protamex hydrolysis, alkaline protease hydrolysis resulted in a decrease in time consumption by 4 h despite showing no significant difference in hydroxyl free radical scavenging capacity. The polypeptide sample obtained by alkaline protease hydrolysis contained 28.4% protein, 11.0% polypeptide and 1.5% free amino acids and indicated an IC50of 8.432 mg/mL against hydroxyl free radicals compared with 0.897 mg/mL for vitamin C.

tea residue protein；protease；hydrolysis；polypeptide；hydroxyl free radical

S571.1；TQ936.1

A

1002-6630(2011)14-0061-06

2010-12-05

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD06B01)；科技部科技人員服務(wù)企業(yè)行動項目(2009GJC10031)；

福建自然科學(xué)基金“杰出青年”資助項目(31096123)；江蘇省科技計劃項目(BE2010345；BM2008144)；

蘇州市科技計劃項目(SZGD201067；WNZ1002；吳政抄2009字65號)；

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-23)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程專項

羅紅玉(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為茶葉化學(xué)與制茶工程。E-mail：roye2008324@126.com

*通信作者：黎星輝(1962—)，男，教授，博士，研究方向為茶樹種質(zhì)創(chuàng)新、茶葉化學(xué)與制茶工程。E-mail：lxh@njau.edu.cn