功能性多糖與家禽腸道黏膜免疫調(diào)控的構(gòu)效關(guān)系

楊小軍 王筱霏 尹瑞卿 姚軍虎

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，楊凌 712100)

胃腸道作為家禽一個重要組織器官既是食物消化吸收的主要場所，又是大多數(shù)病原侵入機體的主要門戶。集約化家禽養(yǎng)殖過程中面臨諸多的應(yīng)激因素，在采食過程中家禽腸道接觸大量的致病性抗原，腸道黏膜免疫系統(tǒng)生理功能很難在短時期內(nèi)發(fā)育完善，故常出現(xiàn)腸道炎癥性疾病;同時，隨著廣譜、高效抗生素的大量使用，腸道黏膜菌群平衡遭到破壞，使得腸道黏膜表面條件性致病菌感染顯得較為突出，如大腸桿菌腸炎。另外，自2006年歐盟全面叫停飼料用抗生素后，雞肉中抗生素殘留等問題也極大地阻礙了我國雞肉產(chǎn)品的出口。特異、高效細菌抗性物質(zhì)的研發(fā)將極大推動我國肉雞養(yǎng)殖的高效、健康發(fā)展，提高我國畜禽產(chǎn)品的國際競爭力。

多糖是一類廣泛存在于動物、植物和微生物細胞中具有特殊活性的重要生物大分子物質(zhì)。隨著分子生物學(xué)研究的進展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)不同來源的多糖具有廣泛而復(fù)雜的生物活性，已經(jīng)引起醫(yī)藥界高度重視，并成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點之一。功能性多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤作用、抗病毒作用、抗衰老作用、抗動脈粥樣硬化作用、對物質(zhì)代謝具有影響、抗?jié)冏饔?、類腎上腺皮質(zhì)激素和促腎上腺皮質(zhì)激素作用以及對輻射損傷的保護等作用。多糖的構(gòu)效關(guān)系是指多糖的一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)與其生物活性之間的關(guān)系，化學(xué)結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，是當(dāng)今糖化學(xué)和糖生物學(xué)共同關(guān)注的焦點問題。

我國對多糖的研究起步比較晚，始于20世紀70年代，但近年來發(fā)展迅速，研究對象涉及真菌類、地衣類、植物、花粉和動物等。研究的范圍包括多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)分析、理化性質(zhì)、免疫學(xué)、藥理學(xué)以及治療應(yīng)用等，對其免疫增強作用機制的研究已深入到分子和受體水平。研究的方法涉及化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)等諸多領(lǐng)域。我國動物營養(yǎng)學(xué)家近些年試圖從不同角度來研究控制腸道細菌性疾病，也研制出一些產(chǎn)品，如多糖、酸化劑和益生素等。但在多糖的應(yīng)用上存在很大的盲目性，在未明晰具有抗性的功效物質(zhì)及其作用機制的情況下，隨意地選擇中藥多糖進行添加，極大地制約了多糖類抗菌物質(zhì)的應(yīng)用。本文旨在在綜述多糖的研究現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上探討多糖結(jié)構(gòu)與其免疫調(diào)節(jié)作用的構(gòu)效關(guān)系，以期為多糖飼料添加劑的合理應(yīng)用和研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 多糖研究現(xiàn)狀

目前，以多糖結(jié)構(gòu)、功能和藥用研究為核心的糖工程被認為是繼蛋白質(zhì)工程、基因工程后生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域中最具挑戰(zhàn)性的一個科學(xué)前沿，迄今已有數(shù)百種植物、微生物多糖被分離提取，研究的對象涉及真菌類、地衣類、植物以及花粉、微生物等多種來源的多糖［1－2］。多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由不同的單糖殘基在不同的連接位置以不同類型的糖苷鍵連接，形成具有不同構(gòu)象、不同相對分子質(zhì)量的多糖。多糖的結(jié)構(gòu)決定其功能，而多糖的分離純化是結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)，因此國內(nèi)外的學(xué)者在多糖的分離、純化、結(jié)構(gòu)分析、結(jié)構(gòu)修飾以及活性測定方面做了大量的研究工作，發(fā)現(xiàn)它們具有抗氧化、抗疲勞、降血糖、抗腫瘤、抗病毒、降血脂和調(diào)節(jié)機體免疫能力等多方面的藥理作用，尤其是對免疫功能的調(diào)節(jié)［1－8］。但是因為功能性多糖類化合物在天然產(chǎn)物中含量低，而且分離提取困難，部分多糖的質(zhì)量標(biāo)準不易控制，限制了多糖的研究，使其遠遠落后于蛋白質(zhì)和核酸的研究。目前多糖的研究仍側(cè)重于分離純化、化學(xué)組成及生物活性等方面，對多糖的空間結(jié)構(gòu)及其在體內(nèi)的作用機制等都未及深入。中國的多糖資源十分豐富，具有十分巨大的開發(fā)潛力，而且隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分離純化技術(shù)的不斷進步，傳統(tǒng)方法與現(xiàn)代科學(xué)儀器的結(jié)合使用，多糖越來越多的性質(zhì)被人們所認識，也逐步地應(yīng)用于臨床各種疾病的治療當(dāng)中，如用于慢性乙型遷延性肝炎及消化道腫瘤的放、化療輔助藥物香菇多糖注射液(批準文號:國藥準字 H20030131;藥品本位碼:86904840000308;生產(chǎn)單位:金陵藥業(yè)股份有限公司福州梅峰制藥廠)，用于預(yù)防和治療慢性支氣管炎、感冒及哮喘的卡介菌多糖核酸注射液(批準文號:國藥準字 S20020019;藥品本位碼:86904944000013;生產(chǎn)單位:湖南斯奇生物制藥有限公司)和用于治療慢性肝炎、腫瘤病的豬苓多糖注射液(批準文號:國藥準字Z11020812;藥品本位碼:86900243000075;生產(chǎn)單位:中國中醫(yī)科學(xué)院實驗藥廠)等(國家食品藥品監(jiān)督管理局)。因此，多糖的結(jié)構(gòu)及功能研究正在逐步地進行中，有著廣闊的前景和研究空間。

2 多糖的免疫調(diào)控作用

大腸桿菌感染造成肉雞生長發(fā)育遲緩、生產(chǎn)性能下降、飼料報酬下降、死淘率及屠宰廢棄率增加以及藥費增加等，給養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失。大腸桿菌關(guān)鍵性致病因子脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)又稱內(nèi)毒素，位于革蘭氏陰性細菌的外膜中，可激活單核巨噬細胞、內(nèi)皮細胞合成并釋放多種細胞因子，導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)。在畜禽養(yǎng)殖中常導(dǎo)致一系列病理反應(yīng)，包括膿毒癥、膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征等。LPS進入循環(huán)系統(tǒng)后，刺激免疫細胞產(chǎn)生大量具有致熱效應(yīng)的炎性細胞因子，如NF-κB，引發(fā)細菌感染。LPS還會啟動補體系統(tǒng)及活化T細胞，引起個體免疫系統(tǒng)的過度活化。隨著“LPS受體激活簇”理論的提出，開展LPS結(jié)構(gòu)性識別與跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細胞炎癥反應(yīng)構(gòu)效關(guān)系的研究將對預(yù)防畜禽養(yǎng)殖應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有很好的推動作用。

早有研究證實，K1莢膜多糖是侵入性大腸桿菌的一種很重要的致病因素［9］。最新研究報道，革蘭氏陰性菌LPS可誘發(fā)動物腸道、肺、心、腎和肝的炎癥反應(yīng)［10－12］。有研究發(fā)現(xiàn)，動植物致病菌的胞外多糖可以通過鰲合鈣抑制非特異性免疫應(yīng)答［13］。Chang 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，鮑氏針層孔菌多糖(PBP)可以顯著增強LPS和伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激的小鼠 B、T淋巴細胞增殖，且PBP在12.5～100.0μg/m L呈劑量依賴型抑制淋巴細胞一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，結(jié)果提示PBP可以刺激免疫活性并抑制炎癥反應(yīng)。以上表明，一些功能性多糖可能具有增強動物體對致病性細菌抗性的作用。Guo等［15］研究發(fā)現(xiàn)，中草藥多糖可以增強感染柔嫩艾美爾球蟲肉雞的免疫反應(yīng)，減輕因感染球蟲所致的體增重下降，表明多糖對于增強球蟲抗性效果起到了很好的保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以顯著增加肉雞ND抗體滴度和淋巴細胞增殖，改變 CD3+、CD4+和 CD8+T細胞比例，增強正常免疫程序下肉雞的免疫效果［16］。Xu等［17］研究發(fā)現(xiàn)，LPS可經(jīng)TLR4/PI3K途徑誘發(fā)免疫細胞分泌炎癥信號分子(高遷移率基團box-1)。Kim等［18］發(fā)現(xiàn)松菇多糖可以促進受LPS刺激的巨噬細胞分泌 NO，并提高 IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α基因的表達，其機制可能涉及松菇多糖的TMF-Ⅱ可以使IκB磷酸化從而活化NF-κB。酵母細胞壁多糖占細胞壁干重的90%，主要有α－D－甘露聚糖和β－D－葡聚糖，二者與免疫系統(tǒng)有明顯的互作特性，多糖的合理應(yīng)用可以調(diào)控黏膜免疫從而維護動物健康、抵抗疾病。酵母細胞壁多糖可以減少致病菌鞭毛在腸道黏膜上皮細胞的黏附，降低致病菌毒素的危害，加快致病菌的排出［19］。由此可見，多糖可以作為一種天然生長促進劑應(yīng)用在家禽生產(chǎn)中。

3 多糖構(gòu)效關(guān)系研究

多糖的結(jié)構(gòu)是決定其生物活性的最主要因素，而構(gòu)效關(guān)系的研究將為多糖的目的性篩選和分子修飾提供理論指導(dǎo)。分子修飾是通過化學(xué)、物理和生物學(xué)方法對高分子化合物進行結(jié)構(gòu)改造，以獲得功能、活性更強衍生物的方法，是通過改變多糖的空間結(jié)構(gòu)、分子量及取代基的種類、數(shù)目和位置來發(fā)揮作用的。但多糖構(gòu)效關(guān)系研究還未及深入，只能確定高級結(jié)構(gòu)比一級結(jié)構(gòu)在活性方面起更大的作用。

對于水溶性β－D－1，3－葡聚糖，只有分子量大于90 ku才能形成3股螺旋的高度有序結(jié)構(gòu)，具有3股螺旋結(jié)構(gòu)的葡聚糖大多都有多糖的免疫活性［20］。LPS可經(jīng)TLR4途徑誘發(fā)腸道上皮細胞炎癥反應(yīng)，而幽門彎曲菌LPS經(jīng)TLR2/MEK 1/2-ERK1/2信號通路促進 IL-8分泌，誘發(fā)腸道疾病［21］，表明不同細菌胞外LPS與宿主細胞的互作通路也是不一樣的，即多糖結(jié)構(gòu)決定其生物學(xué)功能。

利用核磁共振技術(shù)(NMR)對來自腸聚集性大腸桿菌522/C1菌株和大腸桿菌O/178菌株的抗原多糖結(jié)構(gòu)的比較發(fā)現(xiàn)，這2種抗原多糖具有完全相同的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元［22］。A li等［23］在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，來自腸聚集性大腸桿菌87/D2菌株和大腸桿菌O128菌株的抗原多糖含有的乙酰基具有相似的作用。通過分析來自大腸桿菌87的抗原多糖發(fā)現(xiàn)，水解產(chǎn)物包括海藻糖、葡萄糖、半乳糖、2－氨基－2－脫氧葡萄糖、2－氨基－2－脫氧半乳糖和庚糖，它們之間比率為 22∶12∶22∶4∶35∶4。Kiyohara等［24］研究認為，黃芪多糖 β －D －1，3－半乳糖體或β－D－1，6－半乳糖基的降解將顯著降低其對腸道派伊爾氏斑淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)活性。提示β－D－1，3－半乳糖或β－D－1，6－半乳糖基在黃芪多糖免疫調(diào)節(jié)活性上有重要作用。在對太白茶多糖的4個組分分析中發(fā)現(xiàn)，由于其糖組成、分子量和連接方式不同而表現(xiàn)出了不同的免疫活性［25］。Telepnev 等［26］研究分析，LPS ?；?，能抑制樹突細胞TLRs受體介導(dǎo)的涉及炎癥反應(yīng)的信號通路。這一試驗驗證了多糖結(jié)構(gòu)的改變將影響到其生物學(xué)功能。硫酸化多糖在免疫調(diào)節(jié)上反映出雙面性——抑制或促進。硫酸化多糖可以抑制炎性細胞因子介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，表現(xiàn)在抑制補體活化、抑制淋巴細胞黏附或穿越內(nèi)皮細胞。相反，細菌分泌的硫酸化多糖可以激活免疫細胞，促進抗原識別和捕獲。其作用與其結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，如分子量、硫酸化位點的不同，尤其是硫酸化二糖程度、硫酸化位置和硫酸化結(jié)構(gòu)域，也許其是決定多糖免疫作用不同的主要原因［27］。多數(shù)革蘭氏陰性(G－)細菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、克雷伯氏菌和沙雷氏菌等都含LPS，其中O－特異的、富含甘露糖的多糖(甘露聚糖)具有一些免疫特性。LPS具有同質(zhì)甘露糖聚合物，其在激活補體系統(tǒng)活性上要高于異質(zhì)多糖，可以激活補體系統(tǒng)誘導(dǎo)非特異性免疫，但由于許多細菌有復(fù)雜的細胞外膜結(jié)構(gòu)，所以能夠?qū)ρa體系統(tǒng)產(chǎn)生良好的抗性［28］。由上述可知，多糖的結(jié)構(gòu)與其生物學(xué)功能有著密不可分的關(guān)系，對多糖結(jié)構(gòu)進行適當(dāng)?shù)男揎椏梢栽鰪娖渖飳W(xué)功能。

4 小結(jié)

不同結(jié)構(gòu)的多糖其免疫調(diào)節(jié)活性功能不一，現(xiàn)仍普遍缺乏具體核心寡糖片段與腸道上皮細胞或腸道淋巴細胞分子靶標(biāo)的點對應(yīng)的構(gòu)效關(guān)系研究。針對現(xiàn)有研究現(xiàn)狀和本課題組工作基礎(chǔ)，筆者認為分析功能性多糖的定植位點和結(jié)構(gòu)，比對分析不同多糖與LPS的分子結(jié)構(gòu)和作用的分子靶標(biāo)，構(gòu)建多糖與分子靶標(biāo)的構(gòu)效關(guān)系及其下游信號通路，將為具有家禽腸道免疫功能調(diào)控作用的多糖的目的性篩選、定向分子修飾及抗生素替代品的開發(fā)研究提供理論支持。

［1］ COSTA L S，F(xiàn)IDELISG P，CORDEIRO S L，etal.Biological activities of sulfated polysaccharides from tropical seaweeds［J］.Biomedicine ＆ Pharmacotherapy，2010，64:21－28.

［2］ YIN H，WANG Y，CHEN T，et al.Purification，characterization and immuno-modulating properties of polysaccharides isolated from Flammulina velutipes mycelium［J］.American Journal of Chinese Medicine，2010，38:191－204.

［3］ CAO W，LI X Q，WANG X，et al.Characterizations and anti-tumor activities of three acidic polysaccharides from Angelica sinensis(Oliv.)Diels［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2010，46:115－122.

［4］ ZHANG Y，LU X，ZHANG Y N，et al.Sulfated modification and immunomodulatory activity of watersoluble polysaccharides derived from fresh Chinese persimmon fruit［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2010，46:67 －71.

［5］ CHOIE Y，HWANG H J，KIM IH，et al.Protective effects of a polysaccharide from Hizikia fusiformis against ethanol toxicity in rats［J］.Food and Chem ical Toxicology，2009，47:134－139.

［6］ LIR，CHENW，WANGW，etal.Extraction，characterization of Astragalus polysaccharides and its immunemodulating activities in rats w ith gastric cancer［J］.Carbohydrate Polymers，2009，78:738 －742.

［7］ ZHAO T T，ZHANG Q B，QIH M，etal.Extension of life span and improvement of vitality of Drosophila melanogaster by long-term supplementation w ith different molecular weight polysaccharides from Porphyra haitanensis［J］.Pharmacological Research，2008，57:67－72.

［8］ TOGOLA A，INNGJERDINGEN M，DIALLO D，et al.Polysaccharides w ith com plement fixing and macrophage stimulation activity from Opilia celtidifolia，isolation and partial characterisation［J］.Journal of Ethnopharmacology，2008，115:423－431.

［9］ SILVER R P，AARONSON W，VANN W F.The K1 capsular polysaccharide of Escherichia coli［J］.Reviews of Infectious Diseases，1988，10:S282 －S286.

［10］ WOLFS T，DERIKX J P M，HODIN C，et al.Localization of the lipopolysaccharide recognition complex in the human healthy and inflamed premature and adult gut［J］.Inflammatory Bowel Diseases，2010，16:68－75.

［11］ YANG JW，XU J，CHEN X Y，et al.Decrease of plasma platelet-activating factor acetylhydrolase activity in lipopolysaccharide induced Mongolian gerbil sepsismodel［J］.PLoSONE，2010，5:1 － 3.

［12］ YAO H P，QIAN Y，SHAO X T，etal.Construction of a recombinant adenovirus vector expressing IL-18BP/IL-4 fusion gene and the anti-inflammatory effect induced by this gene on lipopolysaccharidestimulated synovial fibroblasts［J］.Inflammation Research，2010，59:97－104.

［13］ ASLAM S N，NEWMAN M A，ERBS G，et al.Bacterial polysaccharides suppress induced innate immunity by calcium chelation［J］.Current Biology，2008，18:1078－1083.

［14］ CHANG ZQ，OH B C，RHEEM H，et al.Polysaccharides isolated from Phellinus baumii stimulate murine splenocyte proliferation and inhibit the lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in RAW 264.7 murine macrophages［J］.World Journal of M icrobiology＆ Biotechnology，2007，23:723－727.

［15］ GUO F C，KWAKKEL R P，W ILLIAMS B A，et al.Coccidiosis immunization:effects ofmushroom and herb polysaccharides on immune responses of chickens infected w ith Eimeria tenella［J］.Avian Diseases，2005，49:70－73.

［16］ QIU Y，HU Y L，CUIB A，etal.Immunopotentiating effects of four Chinese herbal polysaccharides adm inistered at vaccination in chickens［J］.Poultry Science，2007，86:2530－2535.

［17］ XU H，SU Z L，WU J，etal.The alarm in cytokine，high mobility group box 1，is produced by viable cardiomyocytes and mediates the lipopolysaccharide-induced myocardial dysfunction via a TLR4/phosphatidylinositol 3-kinase gamma pathway［J］.Journal of Immunology，2010，184:1492－1498.

［18］ KIM JY，BYEON SE，LEE Y G，et al.Immunostimulatory activities of polysaccharides from liquid culture of pine-mushroom Tricholoma matsutake［J］.Journal of M icrobiology and Biotechnology，2008，18:95－103.

［19］ KOGAN G，KOCHER A.Role of yeast cell wall polysaccharides in pig nutrition and health protection［J］.Livestock Science，2007，109:161－165.

［20］ OHNO N，KURACHI K，YADOMAE T.Physicochem ical properties and antitumor activities of carboxymethylated derivatives of glucan from Sclerotinia sclerotiorum［J］.Chem ical＆ Pharmaceutical Bulletin，1988，36:1016－1025.

［21］ YOKOTA S，OKABAYASHI T，REHLIM，et al.Helicobacter pylori lipopolysaccharides upregulate toll-like receptor 4 expression and proliferation of gastric epithelial cells via the MEK1/2-ERK1/2 m itogenactivated protein kinase pathway［J］.Infection and Immunity，2010，78:468－476.

［22］ ALIT，URBINA F，WEINTRAUB A，et al.Struc-tural studies of the O-antigenic polysaccharides from the enteroaggregative Escherichia coli strain 522/C1 and the international type strain from Escherichia coli O178［J］. Carbohydrate Research， 2005， 340:2010－2014.

［23］ ALIT，WEINTRAUB A，W IDMALM G.Structural studies of the O-antigenic polysaccharides from the enteroaggregative Escherichia coli strain 87/D2 and international type strains from E.coli O128［J］.Carbohydrate Research，2008，343:695－702.

［24］ KIYOHARA H， UCHIDA T， TAKAKIWA M，et al.Different contributions of side-chains in beta-D-(1-＞3，6)-galactans on intestinal Peyer’s patch-immunomodulation by polysaccharides from Astragalus mongholics Bunge［J］.Phytochem istry，2010，71:280－293.

［25］ OMARSDOTTIR S， FREYSDOTTIR J， OLAFSDOTTIR E S.Immunomodulating polysaccharides from the lichen Thamnolia vermicularis var.subuliformis［J］.Phytomedicine，2007，14:179 － 184.

［26］ TELEPNEV M V，KLIMPEL G R，HAITHCOAT J，et al.Tetraacylated lipopolysaccharide of Yersinia pestis can inhibit multiple toll-like receptor-mediated signaling pathways in human dendritic cells［J］.Journal of Infectious Diseases，2009，200:1694－1702.

［27］ CHEN D，WU X Z，WEN Z Y.Sulfated polysaccharides and immune response:promoter or inhibitor?［J］.Panm inerva Medica，2008，50:177 －183.

［28］ TICHACZEK-GOSKA D，CISOWSKA A.Selected properties of lipopolysaccharides possessing the mannan as O-specific polysaccharides of gram-negative bacteria［J］.Advances in Clinical and Experimental Medicine，2007，16:105－112.