脈沖電場誘導(dǎo)細胞凋亡機制及其在腫瘤治療中應(yīng)用前景展望*

李好山綜述,熊正愛△,姚陳果審校

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科 400010;2.重慶大學(xué)輸配電裝備及系統(tǒng)安全與新技術(shù)國家重點實驗室 400030)

脈沖電場以其獨特的生物電效應(yīng)在腫瘤治療等領(lǐng)域展示出良好的發(fā)展前景,并在國際上掀起了一股研究熱潮。Weaver等[1-2]發(fā)現(xiàn)在場強為1 kV/cm級、脈寬為100 μ s級的陡脈沖作用下,細胞膜出現(xiàn)微孔的同時電導(dǎo)率發(fā)生改變,當(dāng)施加在細胞膜上的跨膜電位超過膜的絕緣強度時,電導(dǎo)率將激增,導(dǎo)致細胞膜阻礙微粒滲透能力降低,膜上出現(xiàn)親水性孔道;當(dāng)脈沖取消后,大多數(shù)情況下微孔會關(guān)閉而不會對細胞造成任何影響,這種細胞膜出現(xiàn)暫時微孔的物理過程稱為電穿孔效應(yīng)。Okino等[3]首次將其與化療藥物相結(jié)合治療腫瘤,創(chuàng)立了電化學(xué)療法。進一步研究[4-5]發(fā)現(xiàn),當(dāng)場強升高到100 kV/cm級同時脈寬降低至10 ns級,細胞出現(xiàn)核膜可逆性穿孔,微核產(chǎn)生,基因表達增強;線粒體膜可逆性穿孔并導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子釋放;抑制荷瘤動物腫瘤組織的生長;誘導(dǎo)細胞周期發(fā)生改變等。相對于細胞電穿孔效應(yīng),這種現(xiàn)象稱為胞內(nèi)電處理效應(yīng)。盡管上述生物電效應(yīng)的機制尚不十分清楚,但陡脈沖以其獨特的電穿孔效應(yīng)和胞內(nèi)電處理效應(yīng)等重要特征已在國內(nèi)外掀起研究熱潮。Schoenbach于2004年在《Nature》預(yù)言陡脈沖將在近幾年內(nèi)可望實現(xiàn)臨床試驗并逐步得到應(yīng)用,這種方法不需要毒性藥物的輔助作用就能達到良好的殺滅腫瘤細胞的效果,可以避免炎癥、潰瘍和化學(xué)藥物等導(dǎo)致的不良反應(yīng)。研究者們對電穿孔效應(yīng)和胞內(nèi)電處理效應(yīng)研究的實質(zhì)是陡脈沖的可逆性電擊穿效應(yīng)在腫瘤治療中的應(yīng)用。另有研究成果[6-7]表明陡脈沖不但能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生可逆性電擊穿,即電穿孔和胞內(nèi)電處理效應(yīng),而且在保證患者安全的前提下,將恰當(dāng)參數(shù)組合的陡脈沖引入到腫瘤組織中,使細胞發(fā)生不可逆性電擊穿效應(yīng),并誘導(dǎo)細胞凋亡效應(yīng),可以達到殺傷腫瘤細胞的目的,同時還可誘發(fā)機體抗血管和淋巴轉(zhuǎn)移效應(yīng)、免疫效應(yīng)等,破壞腫瘤的生存條件,有效地減少了腫瘤細胞轉(zhuǎn)移到其他部位的可能性并改善患者的生存質(zhì)量,從而提高了治療的有效性和安全性。

1 凋亡誘導(dǎo)與腫瘤治療

細胞凋亡,又叫細胞程序性死亡,是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡有利他性,使周圍的細胞長得更好,或是滿足發(fā)育過程和免疫功能的需要。通過對細胞凋亡及其機制的研究將有助于揭示免疫效應(yīng)、細胞惡變等重大生物學(xué)和醫(yī)學(xué)奧秘,從而借助細胞凋亡清除有害細胞,如惡性轉(zhuǎn)化與病毒感染的細胞,成為治療腫瘤的突破口。

腫瘤的發(fā)生是因細胞增殖與死亡的速度平衡失調(diào)而造成,失控的程度決定腫瘤是否發(fā)生,也決定著腫瘤的生長速度。正常的機體可通過凋亡機制清除體內(nèi)受損而不予修復(fù)的細胞,也可清除那些癌前病變、基因改變的細胞。當(dāng)上述細胞不能通過凋亡機制予以清除時,將促進腫瘤的產(chǎn)生。普遍認為,腫瘤的生長速度取決于癌細胞的增殖與死亡之比,因此,治療癌癥的機制常見于抑制癌細胞的生長與增殖。但研究發(fā)現(xiàn),許多腫瘤細胞增殖速度甚至比正常細胞慢,這些腫瘤能夠持續(xù)生長是因為癌細胞的壽命延長。因此,抑制癌細胞的增殖只能延緩腫瘤的進展而不能達到治愈的目的。誘導(dǎo)癌細胞的凋亡能使瘤組織縮小甚至消失,故研究如何誘導(dǎo)細胞凋亡對治療癌癥有極其重要的意義。以往的化療、放療都是通過抑制腫瘤細胞的增殖來達到治療的目的,而細胞凋亡學(xué)說的建立使誘導(dǎo)細胞凋亡來治療腫瘤,為腫瘤治療開辟了一個新的領(lǐng)域。

2 脈沖電場誘導(dǎo)細胞凋亡的實驗研究

脈沖電場因其參數(shù)不同,作用細胞后細胞出現(xiàn)的變化也不同,誘導(dǎo)細胞凋亡被證實是脈沖電場的生物學(xué)效應(yīng)之一,陡脈沖誘導(dǎo)凋亡機制已成為國內(nèi)外研究的熱點。熊蘭等[8]用電壓峰值150 V,頻率100 Hz,脈寬 6.6 us,脈沖陡度為 138 ns,治療時間為 30 min的電脈沖處理接種walker-256瘤細胞的wistar大鼠后觀察到典型的凋亡細胞并伴有Bcl-2/Bax蛋白表達比值的降低。曹曉哲等[9]用參數(shù)為 6×104 V/M,脈沖上升時間為20 ns,脈寬為30 us,以2.5次/min,輻照2 min的電磁場作用于肺癌A549細胞,發(fā)現(xiàn)凋亡率為15.07%,并且抑制凋亡蛋白Bcl-2較對照組表達下降,p53蛋白則較對照組上升。趙梅蘭等[10]用脈沖電場作用于小鼠成纖維細胞后同樣發(fā)現(xiàn)Bc1-2蛋白表達的下調(diào),并檢測到p53蛋白表達上調(diào)。張文霞等[11]用陡脈沖作用于B細胞淋巴瘤組織,采用原位末端標(biāo)記法和免疫組化S-P法檢測到腫瘤細胞凋亡率顯著高于對照組,p53、Bcl-2在處理組表達分別為 80%、25%,對照組表達分別為15%、90%,推測脈沖電場可誘導(dǎo)癌細胞凋亡。楊孝軍等[12]用低能陡脈沖(電壓100 V、頻率75 Hz、脈寬 25 us)作用SKOV3卵巢癌細胞后,DNA片段化分析表明電擊后胞核DNA斷裂、出現(xiàn)梯狀條帶。Mi等[13]發(fā)現(xiàn)陡脈沖電場作用于人肝癌細胞SM MC-7721使線粒體電位出現(xiàn)下降,電壓為600 V,脈寬為100 us時下降更明顯,而且陡脈沖停止作用后還會繼續(xù)下降。謝肇等[14]將脈沖電場作用于骨質(zhì)疏松大鼠成骨細胞和破骨細胞也發(fā)現(xiàn)破骨細胞出現(xiàn)Bax/Bcl-2顯著增高,同時FasL陽性增高。姚陳果等[15]采用場強為 10 kV/cm、脈寬為l00 ns、重復(fù)頻率為l Hz的納秒級陡脈沖電場作用于SKOV3癌細胞,流式細胞術(shù)檢測到癌細胞的早期凋亡率為(22.21±2.71)%,明顯高于對照組的(3.04±0.44)%(P＜0.05),掃描和透射電子顯微鏡均觀察到典型的凋亡細胞形態(tài),證實納秒級陡脈沖電場能夠有效誘導(dǎo)SKOV3癌細胞發(fā)生凋亡;同時納秒級陡脈沖電場可明顯升高細胞鈣離子濃度,而與細胞外鈣離子濃度無關(guān)。由于納秒級陡脈沖電場的等值頻率很高,容易穿透細胞膜,推測其誘導(dǎo)凋亡的機制之一可能是通過激活細胞內(nèi)鈣庫(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體),引起細胞內(nèi)鈣離子升高,從而介導(dǎo)凋亡信號通路。劉歡等[16]用脈沖作用于肝癌細胞SMMC-7721和正常肝細胞HL-7702發(fā)現(xiàn)在細胞外無鈣離子的情況下電壓為200 V時胞內(nèi)鈣離子濃度出現(xiàn)下降,250 V時下降更明顯,而在胞外有鈣離子情況下電壓為150～250 V時胞內(nèi)鈣離子濃度變化不大,推測胞內(nèi)鈣離子濃度變化是陡脈沖誘導(dǎo)凋亡的機制之一。李聰?shù)萚17]用高強度電脈沖(參數(shù)為1 kV、1 KHz、250 ns、1 min)作用人卵巢癌細胞SKOV3后,鈣離子向線粒體流動,其含量比對照組明顯增加;Bcl-2在高強度電脈沖作用后mRNA顯著低于對照組,提示高強度電脈沖作為一種強的外界刺激信號,作用于線粒體外膜,使凋亡信號的細胞傳導(dǎo)和發(fā)生效應(yīng)增強,從而導(dǎo)致卵巢癌組織凋亡。楊方黎等[18]采用納秒級脈沖電場以參數(shù)為300 ns,20 kV/cm,f=1 Hz處理人黑色素瘤細胞裸鼠皮下移植瘤,也得出了脈沖電場能誘導(dǎo)凋亡的結(jié)論。Hofmann等發(fā)現(xiàn)場強為 4.5～8.1 kV/cm,間期為40 us的脈沖電場使Jurkat細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài),HL-60細胞出現(xiàn)DNA片段化和核酸聚合酶的破壞,雖然凋亡與細胞內(nèi)離子關(guān)聯(lián)不明顯,但是細胞懸液中含有一定濃度的離子是必需的。Beebe等[19]研究發(fā)現(xiàn)高強度電場(場強達到 300 kV/cm)作用于人Jurkat和HL-60細胞脈沖到納秒級(10～300 ns)觀察到細胞內(nèi)Caspase激活、細胞色素C釋放,細胞內(nèi)鈣離子升高,由于ns級脈沖主要作用于胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)而非細胞膜,所以,凋亡的誘導(dǎo)與胞膜穿孔關(guān)系不明顯。Hall等[20]在研究p53基因在納秒脈沖誘導(dǎo)凋亡作用時發(fā)現(xiàn),納秒脈沖在作用于人結(jié)腸癌細胞HCT116后只有Bax和cytochrome C水平升高的細胞出現(xiàn)胞膜皺縮,p53+/+和p53-/-的細胞被誘導(dǎo)凋亡的機會是均等的,提示納秒脈沖誘導(dǎo)凋亡是非特異性的,其途徑或許是獨立于線粒體途徑的。Richard等[21]用場強為40 kV/cm,脈寬為300 ns的脈沖電場作用于鼠黑色素瘤,發(fā)現(xiàn)在細胞出現(xiàn)壞死的同時觀察到細胞內(nèi)鈣離子濃度升高,DNA片段化,腫瘤血供減少而誘發(fā)的凋亡。Kim等[22]報道用參數(shù)為60 Hz,14 us的電磁場作用于BALB/c小鼠,原位末端標(biāo)記法檢測到睪丸生殖細胞出現(xiàn)較高的凋亡率,電鏡下發(fā)現(xiàn)退化的睪丸生殖細胞出現(xiàn)核染色質(zhì)固縮。Noriaki等[23]用低電壓脈沖作用于鼠黑色素瘤B16細胞,當(dāng)參數(shù)設(shè)置為電壓場強為7.5 V/mm,脈寬為1 000 ms時凋亡達到了(10.5±1.6)%,對照組僅為(2.8±0.3)%。

3 陡脈沖誘導(dǎo)細胞凋亡機制及應(yīng)用前景

從國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀來看,盡管以可逆性電擊穿(電穿孔、內(nèi)處理)和不可逆性電擊穿的方法做了大量的實驗和理論研究工作,脈沖電場誘導(dǎo)細胞凋亡的機制推測有以下原因:(1)通電后,由于細胞膜通透性發(fā)生改變,質(zhì)子和其他離子在電場內(nèi)移動擴散,陰離子移向正極,陽離子移向負極,使陽極呈強酸性,陰極呈強堿性,局部強酸、強堿可誘發(fā)細胞凋亡。(2)陡脈沖作用過程中,不斷有少量氣泡自電極插入處冒出,推測陽極產(chǎn)生氧氣、氯氣,陰極產(chǎn)生氫氣等氣體。這些氣體是強氧化劑或還原劑,具有殺傷腫瘤細胞,誘發(fā)細胞凋亡的作用。(3)陡脈沖劑量較小時,電激液幾乎無升溫,但當(dāng)陡脈沖劑量較大時,處理組溫度較對照組有明顯升高。治療過程中的局部高溫除導(dǎo)致腫瘤細胞壞死亦有誘發(fā)細胞凋亡的作用。(4)在電滲透作用下,水從陽極移向陰極,造成陽極凝固性壞死,陰極液化性壞死,并導(dǎo)致血管收縮、微血栓形成,腫瘤組織缺血缺氧也可誘發(fā)細胞凋亡。(5)變化的脈沖電場能引起細胞跨膜電位的變化,導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流和細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高,激活DNA內(nèi)切酶,使逃離細胞凋亡程序的癌細胞凋亡。但是由于生物體本身的介電特性、阻抗特性和生物電效應(yīng)的復(fù)雜性以及使用的研究方法和手段的局限性,有關(guān)陡脈沖應(yīng)用于腫瘤治療領(lǐng)域的細胞和動物實驗研究很多,但對于陡脈沖電穿孔、內(nèi)處理特別是不可逆性電擊穿三者的窗口效應(yīng)及規(guī)律,至今尚無統(tǒng)一理論能夠正確地解釋各自的作用機制,也就是說,陡脈沖在腫瘤治療中的生物電效應(yīng)作用機制等共性基礎(chǔ)問題的研究則顯得較為膚淺,上述陡脈沖誘導(dǎo)細胞凋亡的機制也不是都確切明了。然而眾多實驗研究確切地證實了陡脈沖作用后細胞發(fā)生凋亡的存在,而且鑒于細胞凋亡在腫瘤治療中的巨大潛力,這些事實激發(fā)了國內(nèi)外學(xué)者對其確切機制的研究興趣,盡管陡脈沖誘導(dǎo)細胞凋亡研究過程中還有很長的路要走,相信不遠的將來陡脈沖會給患者帶來福音。

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