高效液相色譜法測(cè)定母乳中唾液酸含量

陳海嬌，王 萍，陳 越，李紅衛(wèi)*

(廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，福建 廈門(mén) 361005)

高效液相色譜法測(cè)定母乳中唾液酸含量

陳海嬌，王 萍，陳 越，李紅衛(wèi)*

(廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，福建 廈門(mén) 361005)

建立熒光高效液相色譜(fluorescence detector-high performance liquid chromatography，HPLC-FLD)測(cè)定母乳中唾液酸N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac)和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(N-glycolyl neuraminic acid，Neu5Gc)含量的分析方法。利用酸水解法釋放出母乳中的唾液酸，以4,5-亞甲二氧基-1,2-鄰苯二胺鹽(4,5-methylenedioxy-1, 2-phenylenediamine dihydrochloride，DMB)為衍生化試劑，50℃避光衍生150min，采用熒光高效液相色譜儀檢測(cè)。色譜條件：LiChrosorb RP-18柱(250mm×4mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-超純水(7∶8∶85)，流速0.9mL/min，進(jìn)樣體積10μL，柱溫30℃，熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)373nm，發(fā)射波長(zhǎng)448nm。結(jié)果表明：唾液酸在50～400μmol/L范圍內(nèi)與唾液酸峰面積的線性關(guān)系良好，平均回收率為94.0%，精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為0.4%，穩(wěn)定性RSD為1.0%，重復(fù)性RSD為0.8%，Neu5Ac的最低檢出限為0.02μmol/L，Neu5Gc的最低檢出限位0.03μmol/L。該方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、靈敏度高，可廣泛用于奶粉、牛奶及母乳中唾液酸含量測(cè)定。

母乳； 唾液酸； 熒光高效液相色譜(HPLC-FLD)

唾液酸(sialic acid，SA)是一族神經(jīng)氨酸的氮或氧基取代的衍生物，廣泛存在于很多動(dòng)物組織和體液中，是糖蛋白、低聚糖和糖脂的重要成分。在大部分哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，尤其是大腦灰質(zhì)中，唾液酸的含量相當(dāng)高[1]。此外唾液酸是一種天然的營(yíng)養(yǎng)成分，以其在母乳中的高含量而受到廣泛的關(guān)注，但在牛奶和嬰兒配方奶粉中含量卻很低[2-3]，研究證明它能促進(jìn)嬰兒的認(rèn)知發(fā)育、增強(qiáng)學(xué)習(xí)和記憶能力[4]。

母乳中的唾液酸絕大多數(shù)是Neu5Ac(圖1)，主要是以低聚糖的形式存在[2]。奶粉中的唾液酸主要是Neu5Ac，但也含有一定量的Neu5Gc(圖2)，主要是以蛋白結(jié)合形式存在[2]。雖然母乳中唾液酸的營(yíng)養(yǎng)和生物學(xué)作用還不是很清楚，但是很多研究已證明與低聚糖結(jié)合的唾液酸的抗菌能力[1,5]。也有研究發(fā)現(xiàn)外源性唾液酸有助于嬰兒期的大腦發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶能力[1]。目前，市售配方奶粉已將唾液酸作為奶粉優(yōu)化的一個(gè)參數(shù)，使其更接近母乳的黃金標(biāo)準(zhǔn)。因此，在研究中需要找到一種簡(jiǎn)單可靠方法來(lái)測(cè)定母乳中唾液酸含量，為配方奶的生產(chǎn)提供參考。

目前定量檢測(cè)總唾液酸的方法有很多，例如傳統(tǒng)的基于比色法的間苯二酚法[6]或硫巴比安酸法[7]。牛奶和嬰兒配方奶粉中唾液酸的檢測(cè)方法仍然普遍使用比色法。但是這些方法相對(duì)來(lái)說(shuō)都比較耗時(shí)耗力，成本較高，而且精密度較低。脈沖電化學(xué)高效陰離子交換色譜檢測(cè)法(high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection，HPAE-PAD)也用于唾液酸分析[8]，并且用于奶中唾液酸的檢測(cè)[9]。此外，也有用紫外高效液相色譜法(ultraviolet detector-high performance liquid chromatography，HPLC-UV)測(cè)定奶粉中唾液含量的報(bào)道[10]。唾液酸是一種碳水合物，在自然界中主要是以結(jié)合的形式與黏多糖、糖蛋白和糖脂中的低聚糖鏈相連，像牛奶、配方奶粉和母乳中所含有的大量乳糖、半乳糖、低聚糖等碳水化物復(fù)雜基質(zhì)，酸解后所釋放的唾液酸，與這些糖類混合在一起而很難達(dá)到檢測(cè)所要求的分離度[11]。本研究的目的是建立一種DMB衍生化的HPLC-FLD檢測(cè)方法，可以準(zhǔn)確快速的測(cè)定母乳中唾液酸的含量。

圖2 Neu5Gc的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of Neu5Gc

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10份初乳(產(chǎn)后第3天)，采自于廈門(mén)市婦幼保健院正常產(chǎn)的健康產(chǎn)婦；所有用水均為超純水；4,5-亞甲二氧基-1,2-鄰苯二胺鹽酸鹽(4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediamine di hydrochloride，DMB)、Neu5Ac、Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；甲醇與乙腈均為色譜純 韓國(guó)SK Chemical 公司；硫酸、三氟乙酸、三氯乙酸、冰醋酸、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、2-巰基乙醇(均為分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent-1200型HPLC儀(帶熒光檢測(cè)器) 美國(guó)Agilent公司；色譜柱：LiChrosorb RP-18 柱(250mm×4mm，5μm) 德國(guó)默克公司；0.22μm微孔濾膜 上海楚定分析儀器有限公司；超速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司。

1.3 色譜檢測(cè)條件

色譜柱：LiChrosorb RP-18柱(250mm×4mm，5μm)，柱溫30℃；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)373nm，發(fā)射波長(zhǎng)448nm；流動(dòng)相為甲醇-乙腈-超純水(7∶8∶85)；流速為0.9mL/min；進(jìn)樣體積10μL。

DMB衍生液：8mmol/L DMB，1.5mol/L冰醋酸，0.25mol/L硫代硫酸鈉，0.25mol/L亞硫酸鈉，0.8mmol/L 2-巰基乙醇。

衍生條件：90μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中加入10μL DMB衍生液，50℃避光衍生150min，冷卻至室溫后進(jìn)行液譜分析。

1.4 母乳樣品溶液的制備[2,12]

1.4.1 游離和低聚糖結(jié)合唾液酸含量的測(cè)定

準(zhǔn)確量取500μL乳汁于離心管中，加入等體積的10%的三氯乙酸溶液沉淀蛋白，混勻后冰浴10 m in，再離心30min，將上清液移入新的離心管，于沉淀中加入500μL冷的5%的三氯乙酸洗滌，混勻后在4℃、3000r/min 離心30min，吸取上清液到第1次的上清中，即合并兩次上清液。合并的上清液加入等體積0.1mol/L三氟乙酸80℃水解30min，取出后冷卻, 經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，精確吸取過(guò)濾后的溶液90μL，加10μL DMB 50℃避光衍生150min，冷卻后進(jìn)行液譜分析，此為母乳中游離的和與低聚糖結(jié)合的唾液酸之和。

1.4.2 蛋白結(jié)合唾液酸含量的測(cè)定

于1.4.1節(jié)處理后的沉淀中加入2mL(0.05mol/L)硫酸，80℃水解120min，取出后冷卻, 經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，精確吸取過(guò)濾后的溶液90μL，加10μL DM B 50℃避光衍生150min，冷卻后按色譜條件分析。

1.4.3 總唾液酸含量

雖然唾液酸也有少部分以糖脂(神經(jīng)節(jié)苷脂)的形式存在，但是在母乳總唾液酸含量中所占的比例卻很低(＜0.5%)[13]，所以本研究未單獨(dú)檢測(cè)(包含于游離和與低聚糖結(jié)合唾液酸中)。母乳中總唾液酸含量即為游離的、與低聚糖結(jié)合的和與蛋白結(jié)合的唾液酸含量之和。

1.5 唾液酸的定性與定量

通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中唾液酸的保留時(shí)間定性，根據(jù)唾液酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算母乳中唾液酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 唾液酸的衍生化原理

唾液酸本身不具有熒光，但其在酸性條件下能與DMB衍生液衍生生成DMB衍生物[14](圖3)，該衍生物經(jīng)373nm激發(fā)光激發(fā)后，在484nm能夠產(chǎn)生可辨識(shí)可定量的較強(qiáng)熒光信號(hào)，從而在色譜儀中被識(shí)別并產(chǎn)生唾液酸的圖譜。

圖3 Neu5Ac和DMB的衍生化原理Fig.3 Derivatization principles of Neu5Ac and DMB

2.2 唾液酸的色譜圖

圖4為Neu5Ac和Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖，Neu5Ac的保留時(shí)間為13.778min，Neu5Gc的保留時(shí)間為9.855min。圖5、6分別為母乳中游離唾液酸和與低聚糖結(jié)合的唾液酸、與蛋白質(zhì)結(jié)合的唾液酸的色譜圖，據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間可判定圖5中13.753min和圖6中13.750min的色譜峰分別對(duì)應(yīng)的是母乳中游離的和經(jīng)酸解后釋放的與低聚糖結(jié)合的和與蛋白質(zhì)結(jié)合的Neu5Ac的色譜峰。采用本方法檢測(cè)母乳樣品時(shí)未檢測(cè)到Neu5Gc。

圖4 Neu5Ac和Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.4 Chromatograms of standard Neu5Ac and Neu5Gc

圖5 母乳中游離的唾液酸和低聚糖結(jié)合唾液酸色譜圖Fig.5 Chromatograms of free and oligosaccharide-bound sialic acid in human milk

圖6 母乳中蛋白結(jié)合唾液酸色譜圖Fig.6 Chromatograms of protein-bound sialic acid in human milk

2.3 線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 唾液酸標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Table 1 Data for preparing standard curve of sialic acid

圖7 Neu5Ac與Neu5Gc唾液酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.7 Standard curves of Neu5Ac and Neu5Gc

精確稱取0.0309g Neu5Ac和0.0325g Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品粉末，分別溶解于100mL超純水中，配成1mmol/L的Neu5Ac和1mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取濃度為1mmol/L的兩種標(biāo)液5、10、20、30、40μL按照表1配成待衍生的混合液，50℃衍生150min后HPLC檢測(cè)，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣2次。以2次峰面積的平均值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，如圖7，標(biāo)準(zhǔn)品在50～400μmol/L濃度范圍內(nèi)，與峰面積的線性關(guān)系較好。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

取3份初乳，加入一定量的Neu5Ac標(biāo)準(zhǔn)品溶液，與樣品同樣實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定唾液酸總量，回收率見(jiàn)表2。平均回收率為94.0%，表明樣品處理過(guò)程中Neu5Ac損失較少。

表2 HPLC-FLD法測(cè)定唾液酸的回收率Table 2 Spike recovery rates of sialic acid in human colostrum determined by HPLC-FLD

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取 200μmol/L Neu5Ac標(biāo)準(zhǔn)品溶液，衍生后重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得6次峰面積分別為：3946、3964、3980、3979、3967和3951，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard de viation，RSD)為0.4%，精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份樣品溶液，分別于其衍生后0、1、2、4、6、8、10h測(cè)定其峰面積，得峰面積分別為9726、9723、9625、9820、9539、9623和9568，計(jì)算得RSD為1.0%，表明該樣品衍生后在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別量取同一個(gè)人的初乳，共6份，按樣品溶液的處理方法處理后進(jìn)樣，得6個(gè)峰面積分別為7456、7436、7320、7459、7468和7489，計(jì)算得RSD為0.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 最低檢出限實(shí)驗(yàn)

取Neu5Ac和Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加水倍比稀釋，按照標(biāo)準(zhǔn)品處理方法測(cè)定，直至被測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度所對(duì)應(yīng)信噪比為3，按公式D1=3NW/A計(jì)算最低檢測(cè)限(D1為最低檢測(cè)限，N為噪音峰高，W為進(jìn)樣質(zhì)量濃度，A為標(biāo)準(zhǔn)品峰高)。結(jié)果Neu5Ac的最低檢出限為0.02μmol/L，Neu5Gc的最低檢出限為0.03μmol/L。

2.9 母乳中唾液酸含量

取10份初乳樣品，按1.4.1、1.4.2和1.4.3節(jié)方法處理后，根據(jù)峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算其含量，10份母乳唾液酸的平均含量為2157.46mg/L。

3 討論和結(jié)論

本方法能同時(shí)對(duì)Neu5Ac和Neu5Gc進(jìn)行分析，兩者可以實(shí)現(xiàn)很好的分離。依本方法，母乳中只檢測(cè)到Neu5Ac，而未檢測(cè)到Neu5Gc。

比色法和色譜光度測(cè)量法等傳統(tǒng)方法是用離子交換柱純化酸水解樣品后的唾液酸[15]，這種方法樣品中唾液酸損失較大，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本研究方法的樣品處理過(guò)程不需要對(duì)唾液酸進(jìn)行純化，操作方便簡(jiǎn)單，避免了唾液酸的損失和O-乙?；漠悩?gòu)化，從而提高了回收率。本實(shí)驗(yàn)方法最主要的特點(diǎn)在于DMB與唾液酸的特異反應(yīng)，其特異性消除了母乳中乳糖等復(fù)雜物質(zhì)對(duì)唾液酸檢測(cè)的影響。用間苯二酚、硫巴比安酸和酶裂解這3種方法檢測(cè)生物組織中的唾液酸，其最低檢出限分別是0.12、0.20mmol/L和0.06mmol/L，重復(fù)性RSD分別為4.5%，3.1%和4.0%[16]，而本方法中Neu5Ac的最低檢出限為0.02μmol/L，Neu5Gc的最低檢出限為0.03μmol/L，重復(fù)性RSD為0.8%，可見(jiàn)本研究方法能使唾液酸含量較低的樣品也可以被檢出，重復(fù)性更好。

總之，通過(guò)線性、回收率、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、最低檢出限和樣品的測(cè)定，充分驗(yàn)證了本方法的可行性，可廣泛用于奶粉、牛奶及母乳中唾液酸的含量測(cè)定。

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Determination of Total Sialic Acid Content in Human Milk by HPLC-FLD

CHEN Hai-jiao，WANG Ping，CHEN Yue，LI Hong-wei*
(Department of Preventive Medicine, Medical College, Xiamen University, Xiamen 361005, China)

An analytical method was developed for determining total content of sialic acids including N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) and N-glycolyl neuraminic acid (Neu5Gc) in human milk. Sialic acid in human milk was released by acid hydrolysis, and derivatized with 4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride at 50 ℃ for 150 min in a dark environment. The separation of sialic acid was achieved on LiChrosorb RP-18 column (250 mm × 4 mm, 5μ m) using methanol-acetonitrile-water (7∶8∶85) as the mobile phase at a flow rate of 0.9 mL/min. Injection volume and column temperature were set at 10μ L and 30 ℃, respectively. The fluorescence excitation and emission wavelengths were 373 nm and 448 nm, respectively. The results showed that the linear range of sialic acid was 50-400μ mol/L. The average recovery rate was 94.0%. The precision, stability and repeatability RSDs were 0.4%, 1.0% and 0.8%, respectively. The limits of detection were 0.02μ mol/L for Neu5Ac and 0.03μ mol/L for Neu5Gc. Therefore, this developed method is characteristics of simple operation, and high reproducibility and sensitivity. It can be widely applied to determine total content of sialic acid in infant formula, cow milk and human milk.

human milk；sialic acid；fluorescence high performance liquid chromatography

TS252.2

A

1002-6630(2011)16-0308-04

2010-11-23

陳海嬌(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：Jessichen2010@hotmail.com

*通信作者：李紅衛(wèi)(1967—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：rocque@xmu.edu.cn