不同防褐化措施對(duì)蘇丹草愈傷誘導(dǎo)以及抗褐化的效果研究

呂宗友,蘇衍菁,趙國(guó)琦,鄔彩霞

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州225009)

蘇丹草(Sorghum sudanense)為高粱屬牧草,原產(chǎn)于非洲北部蘇丹地區(qū),主要以收獲營(yíng)養(yǎng)體為主[1]。蘇丹草具有產(chǎn)量高、耐刈割、再生性能強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、適口性好以及耐貧瘠、抗逆能力強(qiáng)、適應(yīng)范圍廣等優(yōu)點(diǎn),在世界各地均有栽培,是中國(guó)南方主要栽培的牧草之一。但蘇丹草易患病蟲害,且消化率較低。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠提高蘇丹草的抗病性,也能改良蘇丹草的品質(zhì),提高利用率,獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的蘇丹草,緩解南方粗飼料短缺的現(xiàn)狀,推動(dòng)奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。

組織培養(yǎng)技術(shù)是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基礎(chǔ),蘇丹草和所有高粱屬植物一樣,在組織培養(yǎng)過程中易褐化,褐化產(chǎn)生的酚類物質(zhì)影響愈傷的生長(zhǎng),嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致愈傷死亡。褐化包括酶促褐化和非酶促褐化,褐化主要是由酶引起的,過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)在褐化過程中起主要作用[2]。酶促褐化必須具有酶、底物和氧3個(gè)條件。褐化的發(fā)生是由于組織中多酚氧化酶被激活,酚類物質(zhì)化合物被氧化形成褐色的醌類物質(zhì)。引起褐化的酶的底物主要是酚類化合物。

在組織培養(yǎng)防止褐化的研究中,抗褐化劑主要有活性炭(active carbon,AC)、維生素C(VC)、硝酸銀(Ag-NO3)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP)及檸檬酸(citric acid)等。此外,培養(yǎng)基中糖濃度與次生代謝產(chǎn)物的分泌量有一定的關(guān)系[3]。目前,尚未有蘇丹草愈傷褐化防止的研究報(bào)道。本試驗(yàn)擬探討不同防褐化措施對(duì)蘇丹草褐化的防止及對(duì)其愈傷誘導(dǎo)的影響,為開展蘇丹草轉(zhuǎn)基因研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以從日本引進(jìn)的蘇丹草恢復(fù)系2098幼穗為外植體,該材料由南京農(nóng)業(yè)科學(xué)院鐘小仙老師惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 外植體的準(zhǔn)備 采取大小均勻的蘇丹草幼穗在4℃冷藏24 h,用含75%(v/v)酒精棉擦拭幼穗苞殼表面,在無菌的環(huán)境下小心剝離出幼穗,剪成3～4cm小段,先用75%的酒精表面滅菌30 s,再用0.1%(w/v)的升汞滅菌15 min,同時(shí)加入1～2滴的吐溫(tween),最后用無菌水清洗4～5次[4-6]。

1.2.2 培養(yǎng)基的配制及外植體的接種 以MS培養(yǎng)基[7]為基本培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的pH調(diào)至5.8,在121℃、104 kPa下滅菌25 min,后分裝在培養(yǎng)皿中(直徑:90mm;高:15mm)。激素添加量[8]分別為2,4-D 3.0 mg/L,激動(dòng)素(kinetin,KT)0.1 mg/L?？购只瘎┗钚蕴俊VP、VC、檸檬酸、亞硫酸鈉、硝酸銀及不同濃度蔗糖的添加方式如表1。

將外植體接種在培養(yǎng)皿中,每個(gè)培養(yǎng)皿中6～9個(gè),重復(fù)5次。暗培養(yǎng)箱中(25±2)℃培養(yǎng),4周后計(jì)數(shù)。

表1 防褐化物質(zhì)濃度Table 1 The browning agent concentration

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003軟件和SPSS 16.0方差分析過程(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性炭的作用效果

將幼穗接種在培養(yǎng)基上后,幼穗的綠色緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色,大約17 d時(shí),開始有愈傷長(zhǎng)出。大部分愈傷在花序軸上長(zhǎng)出,僅有少量在花序上長(zhǎng)出。經(jīng)過幼穗誘導(dǎo)得到的愈傷大都是致密、黃色的胚性愈傷。當(dāng)培養(yǎng)基中活性炭的濃度為0.05 g/L時(shí)愈傷誘導(dǎo)率增加,但未達(dá)顯著水平(P>0.05);當(dāng)活性炭的濃度增加到0.15 g/L時(shí),愈傷的誘導(dǎo)率顯著增加(P<0.05);當(dāng)活性炭的濃度超過0.15 g/L時(shí),誘導(dǎo)率又有所下降(圖1)?；钚蕴康臐舛葹?.27和0.15 g/L時(shí),褐化率較小,但差異不顯著(圖2)。以上結(jié)果表明,活性炭的濃度為0.15 g/L時(shí),愈傷誘導(dǎo)率最大,褐化率最低,是活性炭添加的最適濃度。

圖1 不同活性炭濃度對(duì)誘導(dǎo)率的影響Fig.1 Effect of different AC concentration on callus induction

圖2 不同活性炭濃度對(duì)褐化的影響Fig.2 Effect of different AC concentration on callus browning

2.2 VC對(duì)褐化的影響

當(dāng)培養(yǎng)基中VC的添加量為0.05 g/L時(shí),誘導(dǎo)率增加。隨著VC濃度的增加,誘導(dǎo)率有增加的趨勢(shì)。當(dāng)添加量為0.35 g/L時(shí),誘導(dǎo)率達(dá)到了最大。VC的添加量繼續(xù)增加時(shí),誘導(dǎo)率不再增加,有下降的趨勢(shì)(圖3)。當(dāng)VC的添加量為0.35 g/L時(shí),愈傷的褐化率最低,當(dāng)VC的濃度繼續(xù)增加時(shí),愈傷褐化率并沒有減少,反而增加(圖4)。

圖3 不同VC濃度對(duì)誘導(dǎo)率的影響Fig.3 Effect of different VCconcentration on callus induction

圖4 不同 VC濃度對(duì)褐化的影響Fig.4 Effect of different VCconcentration on callus browning

2.3 PVP的作用效果

試驗(yàn)中隨著PVP添加量的增加,愈傷率逐漸增加,當(dāng)PVP添加到0.08 g/L時(shí),愈傷率最大,PVP的添加量繼續(xù)增加時(shí),愈傷率減少(圖5)。而當(dāng)PVP的添加量為0.01 g/L時(shí),褐化率有最大值,當(dāng)添加量增加到0.16 g/L時(shí)褐化率最低(圖6)。

圖5 不同PVP濃度對(duì)誘導(dǎo)率的影響Fig.5 Effect of different PVP concentration on callus induction

2.4 硝酸銀對(duì)褐化的影響

硝酸銀在組織培養(yǎng)中運(yùn)用很廣泛,其中起主要作用的是Ag+。試驗(yàn)中Ag+的添加量為0.01 g/L,愈傷誘導(dǎo)率最大。當(dāng)Ag+添加量大于0.01 g/L時(shí),愈傷誘導(dǎo)率降低,當(dāng)Ag+的添加量達(dá)到0.02 g/L時(shí),嚴(yán)重制約愈傷的誘導(dǎo)(圖7)。Ag+的添加量為0.01 g/L時(shí),褐化率最低。當(dāng)Ag+的添加量大于0.01 g/L時(shí),褐化率升高(圖8)。

圖7 不同AgNO3濃度對(duì)誘導(dǎo)率的影響Fig.7 Effect of different AgNO3concentration on callus induction

圖8 不同AgNO3濃度對(duì)褐化的影響Fig.8 Effect of different AgNO3concentration on callus browning

2.5 檸檬酸對(duì)褐化的影響

檸檬酸的添加量為0.5 g/L時(shí),愈傷誘導(dǎo)率略低于對(duì)照組。檸檬酸添加量為1.0 g/L時(shí),愈傷的誘導(dǎo)率增加,之后誘導(dǎo)率有降低的趨勢(shì),檸檬酸添加量增大到2.0 g/L時(shí),愈傷率增加。檸檬酸添加量為5.0 g/L時(shí),愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到最大(圖9)。檸檬酸的添加量為0.5 g/L時(shí),褐化率最大,之后,隨著檸檬酸的添加增加到1.0和1.5 g/L時(shí),褐化率降低,但差異不顯著(P>0.05)。檸檬酸添加量增加到2.0 g/L時(shí),褐化率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖10)。

圖9 不同檸檬酸濃度對(duì)誘導(dǎo)率的影響Fig.9 Effect of different citric acid concentration on callus induction

圖10 不同檸檬酸濃度對(duì)褐化的影響Fig.10 Effect of different citric acid concentration on callus browning

2.6 蔗糖濃度對(duì)褐化的影響

不同的蔗糖濃度也能影響愈傷的誘導(dǎo)率和褐化率。蔗糖濃度為10～40 g/L時(shí),隨著蔗糖濃度的增加,愈傷褐化率增加(圖11),而同樣在蔗糖濃度為10～40 g/L時(shí),愈傷率最大,當(dāng)蔗糖濃度大于40 g/L時(shí),愈傷率下降,褐化率增加。

3 討論

3.1 活性炭對(duì)褐化的影響

Nguyen等[9]報(bào)道,在培養(yǎng)基中添加活性炭的量為1～5 g/L時(shí),能夠明顯減少高粱幼胚產(chǎn)生的酚類物質(zhì)。本試驗(yàn)表明,當(dāng)活性炭的添加量為0.15和0.27 g/L時(shí),能顯著減輕褐化作用,在0.15 g/L時(shí),蘇丹草幼穗的組織產(chǎn)生愈傷誘導(dǎo)數(shù)最大?；钚蕴磕芴岣哒T導(dǎo)率可能是因?yàn)榛钚蕴磕茚尫盼盏纳L(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(PGR)物質(zhì),促進(jìn)愈傷的出愈。光照能分解生長(zhǎng)激素類物質(zhì)。而活性炭的添加也能為外植體提供暗環(huán)境,減少因光照而降解的激素類物質(zhì)[10],保證了外植體所需的足夠濃度的激素,提高了誘導(dǎo)率。

圖11 不同蔗糖濃度對(duì)誘導(dǎo)率和褐化的影響Fig.11 Effect of different sucrose concentration on callus browning and induced

據(jù)報(bào)道,蔗糖經(jīng)過高溫滅菌后,部分降解產(chǎn)生了5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethyl-2-furaldehyde),該類物質(zhì)對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)有抑制作用[11]。在培養(yǎng)基中添加活性炭,能吸附該物質(zhì),保持愈傷的正常生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中活性炭的添加量為0.05 g/L時(shí),愈傷的誘導(dǎo)數(shù)增加不明顯,可能是由于活性炭的添加量不足造成的,當(dāng)活性炭的添加量達(dá)到0.15 g/L時(shí),能吸附5-羥甲基糠醛等生長(zhǎng)抑制物質(zhì),此時(shí)愈傷數(shù)最多?；钚蕴恳材苷T導(dǎo)胚性愈傷的形成[12]。本試驗(yàn)添加活性炭所得到的均為白色、致密的胚性愈傷。外植體接種在培養(yǎng)基中既能吸收 NO3-,又能吸收NH4+,正常情況下吸收NH4+的量大于NO3-,從而使pH降低[13]。如果在培養(yǎng)基中添加活性炭,活性炭能夠使pH保持在5.5～6.0的正常水平,有利于愈傷的正常生長(zhǎng)[14]。本試驗(yàn)的活性炭添加量為0.15 g/L時(shí),有最大的誘導(dǎo)率,也可能與這有關(guān)。也有試驗(yàn)表明,活性炭的添加對(duì)褐化沒有幫助[15],而本試驗(yàn)表明活性炭在一定程度上能抑制褐化,提高愈傷數(shù)。

3.2 VC對(duì)褐化的影響

VC作為褐化抑制劑在組織培養(yǎng)中使用頻率很高,目前有2種處理方式:一是通過對(duì)外植體預(yù)處理[16](浸泡在VC溶液中一段時(shí)間);二是直接添加到培養(yǎng)基中[17]。其防止褐化的機(jī)理也有3點(diǎn):一是VC能清除組織中產(chǎn)生的自由基,減少次生代謝產(chǎn)物酚類物質(zhì)的積累;二是引起褐化的多酚氧化酶(PPO)是一種含銅的蛋白質(zhì),其活性依賴于銅的氧化還原作用。VC能將Cu2+還原成Cu+,抑制了該酶的活性,該種酶不耐熱,在40～50℃時(shí)活性迅速下降,而在室溫至40℃時(shí)則保持穩(wěn)定的活性。

本試驗(yàn)將VC直接加在高溫滅菌后的培養(yǎng)基中,也能明顯降低褐化,當(dāng)VC的添加量為0.35 g/L效果最好。也有報(bào)道認(rèn)為,VC不但降低了酚類物質(zhì)的含量,也延長(zhǎng)了愈傷的存活時(shí)間[17]。但Linington[18]認(rèn)為,在培養(yǎng)基中添加VC對(duì)防止褐化沒有效果。這可能是由于將VC添加到培養(yǎng)基中經(jīng)高溫滅菌破壞了VC,使VC喪失了功能所致。VC也能消除有毒有害物質(zhì)的積累,如GA3,各種生長(zhǎng)激素等,提高愈傷的誘導(dǎo)率[19]。本試驗(yàn)添加VC也提高了誘導(dǎo)率,當(dāng)VC的添加量為0.25 g/L時(shí)效果最好。

3.3 PVP對(duì)褐化的影響

PVP是一種水溶性物質(zhì),通過氫鍵與酚類物質(zhì)結(jié)合,以此來減少酚類物質(zhì)的毒害。Babbar和Gupta[20]認(rèn)為花藥的褐化是因?yàn)榉e累了大量的酚類物質(zhì),PVP能夠吸收酚類物質(zhì),提高花藥的誘導(dǎo)率。Ogita[21]的試驗(yàn)也表明,添加0.25 g/L PVP不但能防止褐化,而且也能提高外植體的誘導(dǎo)率。本試驗(yàn)中添加0.08 g/L PVP時(shí)有最大的誘導(dǎo)率,但此時(shí)的褐化數(shù)不是最少,當(dāng)增大PVP的濃度到0.16 g/L時(shí),褐化數(shù)最少。也有試驗(yàn)表明,PVP能夠防止愈傷組織因產(chǎn)生的酚類物質(zhì)導(dǎo)致的壞死而提高愈傷數(shù)[22],本試驗(yàn)中愈傷數(shù)增加來自兩部分,一部分是增加了愈傷誘導(dǎo)數(shù),二是減少了愈傷的死亡數(shù)。雖然PVP能防止褐化,但不能完全消除褐化[20],當(dāng)PVP的添加量為0.16 g/L時(shí),PVP能最大限度的防止褐化,同時(shí),愈傷數(shù)降低。這可能是高濃度PVP既吸收了酚類物質(zhì),又吸收了各種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(PGR),降低了其在培養(yǎng)基中的濃度,影響了愈傷的誘導(dǎo)。

3.4 硝酸銀對(duì)褐化的影響

植物材料在密閉容器中或受傷后都會(huì)產(chǎn)生乙烯[23],乙烯大量積累會(huì)使愈傷褐化。硝酸銀作為一種褐化抑制劑,其主要作用是抑制乙烯的產(chǎn)生。銀離子通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合位于細(xì)胞膜上的乙烯受體蛋白,阻止或降低乙烯的作用[24],從而防止褐化。乙烯的積累影響了愈傷的生長(zhǎng)及植物形態(tài)的建成,乙烯也能促進(jìn)或抑制愈傷的形成[25]。本試驗(yàn)中添加不同濃度的硝酸銀都能降低褐化,在0.01 g/L時(shí)能將褐化愈傷數(shù)控制在最低水平,但并沒有完全消除褐化。多數(shù)試驗(yàn)表明,添加乙烯抑制劑硝酸銀均能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)[26]和誘導(dǎo)率[27]。本試驗(yàn)添加0.01 g/L的硝酸銀有最多愈傷數(shù),但隨著硝酸銀濃度的升高,愈傷數(shù)減少,這可能是高濃度的銀離子對(duì)愈傷造成了傷害。

3.5 檸檬酸對(duì)褐化的影響

檸檬酸在組織培養(yǎng)中往往作為前處理劑處理外植體來防止褐化[28]。檸檬酸是一種酸性物質(zhì),當(dāng)外植體浸泡在其中時(shí),因其酸性作用降低了外植體本身的pH。多酚氧化酶在pH為6.5左右時(shí)活性最大,隨著pH的降低,多酚氧化酶的活性也降低,檸檬酸通過提供酸性環(huán)境抑制多酚氧化酶的活性防止褐化[29]。這是因?yàn)閜H在4.0以下時(shí),PPO酶活性中心的Cu2+與周圍的結(jié)合開始松弛,在有檸檬酸的條件下,Cu2+和檸檬酸生成了螯合物,除去了PPO酶中的Cu2+,使PPO酶變性失活,從而抑制褐化[30]。本試驗(yàn)用檸檬酸預(yù)處理外植體后,褐化不僅沒有降低,反而更嚴(yán)重了,這可能是檸檬酸對(duì)外植體造成了損傷,此點(diǎn)需深入研究。

本試驗(yàn)中誘導(dǎo)率隨著檸檬酸添加量的增加而增加,在1.0 g/L時(shí),有較大誘導(dǎo)率,之后隨著添加濃度的增加,誘導(dǎo)率降低;當(dāng)檸檬酸的添加量增大到5.0 g/L時(shí),誘導(dǎo)率達(dá)到最大,這可能與檸檬酸也能減少愈傷的壞死有關(guān)[31]。當(dāng)檸檬酸的添加量達(dá)到一定值時(shí),就會(huì)有負(fù)面的效果,這可能是高濃度檸檬酸會(huì)影響愈傷生長(zhǎng)能量代謝過程中的電子轉(zhuǎn)移[32]。本試驗(yàn)檸檬酸的添加量并沒有達(dá)到最大量。

3.6 蔗糖濃度對(duì)褐化的影響

蔗糖在組織培養(yǎng)中作為主要碳源物質(zhì),在組織培養(yǎng)中作為細(xì)胞分裂與生長(zhǎng)的能量來源。經(jīng)高壓滅菌后,部分降解為D-葡萄糖、D-果糖。蔗糖也是細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和褐變有制約作用。一般認(rèn)為,影響外植體褐變的因素有外植體的基因型、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)材料所處的培養(yǎng)環(huán)境等。適當(dāng)增加蔗糖的濃度能增加各種酶的活性[33],從而促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的合成。本試驗(yàn)隨著蔗糖濃度的增加,酚類物質(zhì)的合成增加,褐化的愈傷數(shù)增加。當(dāng)蔗糖濃度的添加量從10 g/L增加到40 g/L時(shí),愈傷褐化數(shù)增加不顯著(P>0.05),當(dāng)蔗糖濃度添加到50 g/L時(shí),褐化愈傷數(shù)顯著增加(P<0.05)。Park等[34]的研究也表明,當(dāng)蔗糖濃度較低時(shí),能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng),高濃度的蔗糖能促進(jìn)褐化。本試驗(yàn)中當(dāng)蔗糖在較低濃度10～40 g/L時(shí),愈傷數(shù)增加,蔗糖濃度大于40 g/L時(shí),愈傷數(shù)降低,褐化數(shù)增加。

4 結(jié)論

不同的褐化防止手段對(duì)蘇丹草愈傷的作用效果是不同的。當(dāng)檸檬酸濃度為5 g/L時(shí),愈傷的誘導(dǎo)數(shù)最大,誘導(dǎo)愈傷效果為:檸檬酸>活性炭>PVP>VC>蔗糖>硝酸銀;在PVP濃度為0.16 g/L時(shí),褐化的防止效果最好:PVP>硝酸銀>VC>活性炭>蔗糖>檸檬酸。添加檸檬酸雖然能得到大量的愈傷,但得到的愈傷顆粒細(xì)小,水漬化嚴(yán)重,褐化數(shù)高,繼代后大部分死亡,因此,檸檬酸不利于用作蘇丹草的褐化抑制劑。經(jīng)活性炭作用后得到的愈傷誘導(dǎo)數(shù)多,呈白色,質(zhì)密,生長(zhǎng)迅速,褐化愈傷少,均為胚性愈傷。在蘇丹草幼穗誘導(dǎo)中,活性炭為最佳的褐化抑制劑,當(dāng)活性炭的添加量為0.15 g/L時(shí),能有效防止褐化,提高愈傷的誘導(dǎo)率。

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