骨水泥的遺傳毒性研究

胡燕平，宋捷，馬銳，王欣，郭雋，王 雪中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價(jià)監(jiān)測中心，北京， 100176

骨水泥的遺傳毒性研究

【作者】胡燕平，宋捷，馬銳，王欣，郭雋，王 雪中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價(jià)監(jiān)測中心，北京， 100176

目的檢測醫(yī)療器械進(jìn)口產(chǎn)品骨水泥的遺傳毒性。材料與方法以骨水泥粉體浸提液與其液體混合液為供試液，采用細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)(Ames 試驗(yàn)) 和小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)(MLA)，在非代謝活化(-S9)和代謝活化(+S9)條件下檢測。Ames 試驗(yàn)采用平板摻入法，檢測了25、50、100 μl /皿 3個劑量組誘發(fā)鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)TA98、TA100、TA1535、TA1537及大腸桿菌(E.coli)WP2 uvrA的回變菌落數(shù)；MLAT采用微孔法檢測了終濃度0.125%、0.25%、0.5% (V/V) 3個濃度組，在+S9/3 h、-S9/3 h、-S9/24 h三種處理?xiàng)l件下誘發(fā)L5178Y細(xì)胞tk+/-基因突變頻率(MF)和小集落突變百分率(SC%)。結(jié)果Ames試驗(yàn)，50、100 μl /皿劑量組在加入磷酸緩沖液或S9混合液后略有沉淀產(chǎn)生，并對TA100、TA1535、WP2 uvrA產(chǎn)生不同程度的抑菌作用，無抑菌劑量誘發(fā)五株菌的回變菌落數(shù)對比DMSO溶媒(陰性)對照組，均無明顯增加；MLA，各濃度組在三種處理?xiàng)l件下誘發(fā)的MF、SC%與其溶媒(陰性)對照組比較，無明顯增加(P＞0.05)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)條件下，骨水泥對測試菌株his-/trp-無明顯誘變作用，對測試細(xì)胞tk+/-及染色體無明顯損傷作用。

骨水泥；細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)；小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)；遺傳毒性

骨水泥主要用于關(guān)節(jié)成形術(shù)、創(chuàng)傷型的關(guān)節(jié)損傷、骨關(guān)節(jié)炎及骨質(zhì)疏松中假體與活體骨組織的固定[1]。為確保產(chǎn)品的使用安全，本文按照醫(yī)療器械產(chǎn)品檢測的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及要求[2-4]，采用細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)(Bacterial Reverse Mutation Assay, Ames test)[5]和小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)(Mouse Lymphoma Assay, MLA)[6]，對骨水泥進(jìn)行了遺傳毒性檢測。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 樣品與對照品

骨水泥由法國Teknimed SAS公司生產(chǎn)、北京勁健昌達(dá)醫(yī)療科技有限公司提供，批號043G/0823，型號Gentafix3 (貨號T040340G)。1套骨水泥包括41.6 g粉體和16.4 g液體，粉體含84.3%聚甲基丙烯酸甲脂、2.3%過氧化苯甲酰、9.6%硫酸鋇、3.8%硫酸慶大霉素；液體含 84.4%甲基丙烯酸甲脂、13.2%甲基丙烯酸丁脂、20 ppm氫醌。將粉體按照0.2 g/ml浸提比例加入介質(zhì)二甲基亞砜(DMSO)，在37℃±1℃、水浴搖床18～20 r/min條件下浸提24 h ±1 h，所得浸提液再與其液體混合，以此混合液作為供試液。陰性對照品(即浸提介質(zhì)) DMSO，TEDIA生產(chǎn)；陽性對照品疊氮鈉（NaN3），MERCK-Schuchardt生產(chǎn)；9-氨基吖啶（9-AA），ACROS ORGANICS生產(chǎn)；2-氨基蒽（2-AA），F(xiàn)luka生產(chǎn)；呋喃基糠酰胺 (AF-2)、苯并芘 (B〔a〕P)，日本和光純藥工業(yè)株式會社生產(chǎn)；甲基甲烷磺酸酯(MMS)、環(huán)磷酰胺(CP)及突變選擇劑三氟胸苷(trifluorothymidine，TFT)，均購自SIGMA。

1.1.2 菌株與細(xì)胞

Ames 試驗(yàn)選用鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型(his-)菌株(S.typhimurium) TA98、TA100、TA1535、TA1537和大腸桿菌色氨酸營養(yǎng)缺陷型(trp-)菌株(E．coli) WP2 uvrA，菌種引自日本(株)生物科學(xué)中心(JBS INC.)。菌種經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室分離篩選、擴(kuò)大培養(yǎng)、特性鑒定合格者置-80℃超低溫冰箱保存。試驗(yàn)前定量接種細(xì)菌凍融液，水浴搖床37℃、120 r/min培養(yǎng)10 h。培養(yǎng)結(jié)束，測定新鮮菌液光密度(OD)，經(jīng)計(jì)算確認(rèn)活菌數(shù)濃度達(dá)1×109/ml以上的菌液用于試驗(yàn)。MLA選用小鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178Y tk+/--3.7.2C，細(xì)胞引自日本國立醫(yī)藥品食品衛(wèi)生研究所，經(jīng)過純化及支原體檢查，合格者擴(kuò)大培養(yǎng)，置液氮保存，復(fù)蘇后傳代5次以內(nèi)使用。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

Ames 試驗(yàn)：營養(yǎng)肉湯 (CM0067 Nutrient broth No.2)，英國OXOID生產(chǎn)；瓊脂粉(Agar Powder)，購自日本。MLA完全培養(yǎng)基由RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO)、NaHCO3（北京化學(xué)試劑公司，終濃度0.2% W/V）、青鏈霉素混合液(KeyGEN，終濃度1%)、丙酮酸鈉(Amresco，終濃度200 μg/ml)配制而成。根據(jù)用途不同，分為含10%馬血清(傳代、處理培養(yǎng))、20%馬血清(96孔板培養(yǎng))和不含馬血清(稀釋)的培養(yǎng)液。TFT，終濃度3 μg/ml。

1.1.4 代謝活化劑

S9由苯巴比妥鈉與β-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)處理大鼠肝而獲得，本實(shí)驗(yàn)室自制。Ames 試驗(yàn)用S9混合液(S9mix)中的S9含量為10%[7]，MLA所用S9在處理液中的終濃度為2%，檢測時(shí)，S9與180 mg/ml的Glucose-6-Phosphate、25 mg/ml的NADP、0.15 mol/L的KCl等輔助因子溶液，按2:1:1:1(ml)的比例配制成S9mix。

1.2方法

1.2.1 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)[7]

采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法。設(shè)立骨水泥(粉體浸提液與其液體混合物)3個劑量組25、50、100 μl/皿，同時(shí)設(shè)立DMSO溶媒(陰性)對照組及陽性對照組，每組平行3皿，在-S9和+S9條件下同時(shí)檢測。平板置37℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)回變菌落數(shù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示。若在-S9和/或+S9條件下，在所設(shè)劑量范圍內(nèi)，一株以上試驗(yàn)菌的回變菌落數(shù)呈現(xiàn)劑量相關(guān)性增加，或一個以上劑量誘發(fā)的回變菌落數(shù)呈現(xiàn)可重復(fù)性并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，判為陽性，反之則為陰性。

1.2.2 小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)[8-9]

采用微孔法設(shè)立骨水泥 (粉體浸提液與其液體的混合液) 終濃度0.125%、0.25%、0.5% (V/V) 3個濃度組，同時(shí)設(shè)立DMSO溶媒(陰性)對照組和陽性對照組(+S9：CP； -S9：MMS)，每組平行2支處理管，在+S9/3 h、-S9/3 h、-S9/24 h三種處理?xiàng)l件下分別進(jìn)行檢測。+/-S9條件下的3 h處理，各組供試液-細(xì)胞處理液于37℃振蕩培養(yǎng)箱中作用3 h；-S9條件下的24 h處理，各組供試液-細(xì)胞處理液于37℃、5%CO2孵箱中靜置作用24 h。處理、清洗后的細(xì)胞于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)2 d進(jìn)行表達(dá)，制備檢測接種效率的PE0、PE2平板，于37℃、5%CO2孵箱分別培養(yǎng)9～10 d、7～8 d；檢測基因突變頻率的MF平板于表達(dá)結(jié)束后制備，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)12～14 d。培養(yǎng)結(jié)束，計(jì)數(shù)含與不含接種效率細(xì)胞克隆的孔數(shù)并計(jì)算PE0和PE2、細(xì)胞相對存活率(RS%)、相對懸浮生長率(RSG)、相對總生長率(RTG)；觀察并分別計(jì)數(shù)含有突變細(xì)胞大集落(LC)、小集落(SC)及大、小集落(LC/SC) 并存的孔數(shù)，計(jì)算基因突變頻率(MF)以及小集落突變百分率(SC%)。采用“Poisson分布兩樣本均數(shù)的比較”方法，將處理組的突變率與溶媒對照組進(jìn)行比較、分析。如果一個或多個濃度組出現(xiàn)濃度依賴性和/或可重復(fù)性的突變率增加，且任意濃度組MF值＞陰性對照組MF值+126 (總體評價(jià)因子，GEF)[10-11]，則判定為陽性結(jié)果，反之則為陰性。

2 結(jié)果

表 1 骨水泥的Ames試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of Ames test on bone cement (χ±s )

2.1細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)

如表1所示，+/-S9條件下，DMSO陰性(溶媒)對照組的回變菌落數(shù)平均值均在文獻(xiàn)[12]報(bào)道的背景數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，陽性對照組誘發(fā)的回變菌落數(shù)均達(dá)到陰性對照組的3倍以上，顯示出明顯的誘變能力。骨水泥(粉體浸提液與其液體混合物)的3個劑量組中，50、100 μl/皿劑量組在加入磷酸緩沖液或S9混合液后略有乳白色沉淀產(chǎn)生，并在培養(yǎng)48 h后表現(xiàn)出對TA100、TA1535、WP2 uvrA三菌有不同程度的抑菌作用，無抑菌劑量誘發(fā)五株菌的回變菌落數(shù)，對比陰性對照組均無明顯增加。

2.2小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果

如表2表3和表4所示，陰性對照組的PE、MF均在本實(shí)驗(yàn)室的背景數(shù)據(jù)范圍內(nèi)(PE:50～160%；MF：110×10-6～250×10-6)；陽性對照組誘發(fā)的MF達(dá)到陰性對照組的3倍以上(P＜0.01)，并以小集落突變體為主。骨水泥(粉體浸提液與其液體的混合液)各濃度組，在三種處理?xiàng)l件下得到的RTG均大于30%，符合本試驗(yàn)方法中細(xì)胞毒性小于90%的要求；與DMSO溶媒(陰性)對照組比較，誘發(fā)的MF未見明顯增加(P＞0.05)。

表2 +S9/3 h條件下骨水泥的MLA試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of MLA on bone cement with S9at 3 h

表 3 -S9/3 h條件下骨水泥的MLA試驗(yàn)結(jié)果Tab. 3 Results of MLA on bone cement without S9at 3 h

表 4 -S9/24 h條件下骨水泥的MLA試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of MLA on bone cement without S9at 24 h

3 討論

骨水泥的成分較為復(fù)雜，多為不溶于水的有機(jī)物質(zhì)，為此本文在實(shí)施檢測前首先對浸提介質(zhì)進(jìn)行了選擇：骨水泥的粉體部分經(jīng)生理鹽水浸提后呈渾濁狀態(tài)，而經(jīng)有機(jī)溶劑DMSO浸提后固、液分層清晰；骨水泥的液體部分與生理鹽水混合后分層而與DMSO相溶。因此，本研究選用了DMSO作為骨水泥的浸提介質(zhì)，而非通常使用的生理鹽水。Ames試驗(yàn)所用5株測試菌可檢測his-/trp-不同點(diǎn)突變，MLA試驗(yàn)的靈敏度高、可檢測tk+/-基因突變和誘裂性兩個遺傳終點(diǎn)。研究結(jié)果表明，骨水泥對檢測堿基置換型突變的三株菌TA100、TA1535、WP2 uvrA具有不同程度的抑菌作用，可能是試驗(yàn)菌對產(chǎn)品含有的硫酸慶大霉素或其它抑制細(xì)菌生長成分的敏感性不同所致(批號043Z/0836、不含硫酸慶大霉素的同類產(chǎn)品骨水泥未出現(xiàn)抑菌現(xiàn)象，資料另發(fā)表)。骨水泥在+S9/3 h、-S9/3 h、-S9/24 h三種處理?xiàng)l件下，誘發(fā)的tk+/-基因突變率及小集落突變百分率，均與陰性對照組相近。另外，該產(chǎn)品中含有文獻(xiàn)報(bào)道的致突變/致癌物氫醌[13-15]，可能因其含量極少而未對研究結(jié)果造成明顯影響。在本實(shí)驗(yàn)條件下，未檢測出骨水泥對his-/trp-具有明顯誘變作用和對tk+/-及染色體具有明顯損傷作用。

[1] 法國Teknimed SAS公司. 醫(yī)療器械注冊產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)YZB/Teknimed 0001-2009[S]. 2009

[2] 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886.3—2008/ISO 10993-3:2003《醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第3部分: 遺傳毒性, 致癌性和生殖毒性試驗(yàn)》[S].

[3] 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886. 12—2005/ISO 10993-12: 2002《醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第12部分: 樣品制備與參照樣本》[S].

[4]《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組. 藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則[S].2007

[5] OECD TG 471, Bacterial Reverse Mutation Test[S]. 1997

[6] OECD TG 476, In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test[S]. 1997

[7] 日本バイオアッセイ研究センター 微生物實(shí)驗(yàn)室. 微生物を用いる変異原性試驗(yàn)手法解説[M]. 第1刷. 神奈川県秦野: 中央労働災(zāi)害防止協(xié)會 日本バイオアッセイ研究センター, 1999: 16-17.

[8] 謝 明.小鼠淋巴瘤細(xì)胞基因突變試驗(yàn)方法[J].癌變·畸變·突變, 2003. 15(3):183-186.

[9] 趙 潔, 胡燕平, 宋 捷, 等. 小鼠淋巴瘤細(xì)胞基因突變方法的建立與應(yīng)用[J]. 毒理學(xué)雜志, 2006. 20(4):268-269.

[10]Martha M.Moore,et.al. mouse lymphoma thymidine kinase gene mutation assay: follow-up meeting of the international workshop on genotoxicity testing—aberdeen, scotland, 2003-assay acceptance criteria, positive controls, and data evaluation[J]. Environmental and Molecular Mutagenesis. 2006, 47: 1-5.

[11]Martha M.Moore, et.al. Mouse lymphoma thymidine kinase gene mutation assay: Meeting of the International Workshop on Genotoxicity Testing, San Francisco, 2005, recommendations for 24-h treatment[J]. Mutation Research, 2007, 627: 36-40.

[12]胡燕平, 宋捷, 李波. 細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)背景數(shù)據(jù)的采集[J]. 中國新藥雜志, 2009, 18 (22): 2110-2112.

[13]McGregor D. Hydroquinone: an evaluation of the human risks from its carcinogenic and mutagenic properties[J]. Crit Rev Toxicol. 2007,37(10):887-914.

[14]Luo L, Jiang L, Geng C, et.al. Hydroquinone-induced genotoxicity and oxidative DNA damage in HepG2 cells[J]. Chem Biol Interact. 2008, 173(1): 1-8.

[15]Regev L, Wu M, Zlotolow R,et.al. Hydroquinone, a benzene metabolite, and leukemia: A case report and review of the literature[J]. Toxicol Ind Health, 2011, Apr 21. [Epub ahead of print]

Genotoxicity Study of Bone Cement

【W(wǎng)riters 】HuYanping, Song Jie, Ma Rui, Wang Xin, Guo Jun, Wang Xue National Center for Safety Evaluation of Drugs, National Institute for Food and Drug Control, Beijing, 100176, China

bone cement, bacterial reverse mutation test (Ames test), mouse lymphoma assay (MLA), genotoxicity.

Q355

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2011.06.008

1671-7104(2011)06-0425-03

2011-09-25

胡燕平，副主任藥師；研究方向：遺傳毒性研究。E-mail: huer64@126.com

【 Abstract 】ObjectiveTo investigate the genotoxicity of bone cement.Material and MethodsTest article was mixed of liquid and the powder extract of bone cement. Using bacterial reverse mutation test (Ames test) and mouse lymphoma Assay (MLA) with and without metabolic activation S9. Ames test was performed by the plate incorporation method for its ability to induce reverse mutations in three treatment dosage groups: 25 μl/plate, 50 μl/plate, 100 μl/plate using S．typhimurium TA98、TA100、TA1535、TA1537 and E. coli WP2 uvrA; In MLA, the mutation frequency (MF) and the percentage of small colony mutants (SC%) of L5178 tk+/-cells induced by bone cement at final concentration of 0.125%, 0.25% and 0.5% (V/V) were calculated and assayed with +S9/3 h, -S9/3 h, -S9/24 h.ResultsSlight precipitations of two dosage group 50 μl /plate and 100 μl/plate were observed after phosphoric acid buffer solution or S9mix added. Growth inhibition effect exists in TA100, TA1535 and WP2 uvrA to varying degrees. Other groups did not cause obvious increases in the mean number of revertant per plate compared with negative control (DMSO). The result of MLA indicated no significant MF or SC% increases (P＞0.05) observed comparing with negative control under all test conditions.ConclusionsThe bone cement did not induce reverse mutation at his-/trp-and there was no obvious damage effect to gene tk+/-or chromosome under this study condition.