乳糖酶研究進(jìn)展

張敏文，顧取良，張博，李荷

(廣東藥學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，廣東廣州510006)

1 乳糖酶的來(lái)源及其特性

乳糖酶存在于植物、細(xì)菌、真菌、放線菌以及哺乳動(dòng)物(特別是嬰兒)的腸道中。目前只有來(lái)源于微生物的乳糖酶有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，利用微生物發(fā)酵法制取乳糖酶，具有酶源豐富、產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、周期短的特點(diǎn)，而且不受季節(jié)、地理位置等因素的影響，不同微生物來(lái)源的乳糖酶的性質(zhì)差別較大(表1)。

2 乳糖酶的基礎(chǔ)研究

2.1 乳糖酶的基本結(jié)構(gòu)及其生物合成

對(duì)乳糖起水解作用的酶是乳糖酶根皮苷水解酶(lactase phlorizin hydrolase，LPH)。LPH是一種腸上皮細(xì)胞微絨毛膜上的糖蛋白，具有乳糖酶和根皮苷水解酶活性，最適pH為5.5～6.0。LPH為一條多肽鏈，有乳糖酶和根皮苷水解酶的作用位點(diǎn)，并通過(guò)COOH末端的一段疏水氨基酸序列連接在腸牯膜微絨毛膜表面。前乳糖酶原由位于氨基末端的信號(hào)肽域、前導(dǎo)肽域、胞外域、疏水的跨膜錨定區(qū)、羧基末段的胞內(nèi)段組成，在信號(hào)肽引導(dǎo)下進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)過(guò)一系列修飾，乳糖酶原進(jìn)入高爾基體后被O-糖基化，然后經(jīng)歷細(xì)胞內(nèi)和腸腔的2次裂解后形成成熟的乳糖酶。

2.2 乳糖酶與基因克隆

1969年哈佛大學(xué)beekwith博士研究小組應(yīng)用DNA分子雜交技術(shù)首次分離得到大腸埃希菌乳糖酶基因，揭開(kāi)了構(gòu)建乳糖酶基因庫(kù)的序幕，已經(jīng)有很多種來(lái)源的乳糖酶基因被克隆。Juajun O等［4］從芽胞桿菌DSM13中克隆出乳糖酶的基因，Rhimi M等［5］從乳酸桿菌屬的菌種中克隆出一種表達(dá)乳糖酶的基因，并且都在大腸埃希菌中進(jìn)行表達(dá)，重組酶的溫度和pH的適應(yīng)性范圍都更寬。王政等［6］利用PCR技術(shù)從保加利亞德氏乳桿菌中克隆出全長(zhǎng)為3 024 bp的乳糖酶基因，并將此基因與不同來(lái)源的乳糖酶基因進(jìn)行同源性比較。

2.3 乳糖酶與基因多態(tài)性

自2002年Enattah提出根皮苷水解酶基因上游C/T-13910和G/A-22018變異型是LD的基因標(biāo)志物以來(lái)，關(guān)于這2個(gè)單核苷酸的研究很多。對(duì)數(shù)百個(gè)腸黏膜活檢的分析表明，基因型C/C-13910與乳糖酶活性(＜10 U/g蛋白)呈負(fù)相關(guān)，而基因型C/T-13910和T/T-13910與乳糖酶活性呈正相關(guān)。C/C-13190基因型在北俄羅斯種群中的比例是35.6%，其他C/T-13910基因附近和與乳糖酶活性有關(guān)的基因在調(diào)查中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，這些乳糖酶不持續(xù)表達(dá)的人群對(duì)牛奶的消耗比乳糖不耐受的群體低，但是不顯著［7］。在老年人群中調(diào)整乳制品攝入量，證明C/T-13910基因多態(tài)性還和肥胖相關(guān)［8］，對(duì)于單基因底物延展技術(shù)處理過(guò)的基因型為C/T-13910的病人，在攝入50 g乳糖之后進(jìn)行呼氣氫試驗(yàn)［9］，26%的病人是CC基因型積極反應(yīng)，74%是CC基因型消極反應(yīng)(其中48%是TC基因型，26%是TT基因型)基因頻率沒(méi)有變化，在CC基因型中，基因型和呼氣氫試驗(yàn)是相關(guān)聯(lián)的。

Oct-1、GATA、叉頭框和HNF-4α結(jié)合位點(diǎn)等構(gòu)成乳糖酶增強(qiáng)子，變異型C/T-13910位于增強(qiáng)子的中央，變異型T-13910轉(zhuǎn)錄活性是C-13910的3～6倍。在乳糖酶基因上游的基因G-13914也和乳糖酶基因活性增強(qiáng)有關(guān)［10］。Oct-1和HNF-4α結(jié)合位點(diǎn)在基因C/G-14010周圍，實(shí)驗(yàn)證明基因型C-14010比G-14010對(duì)Oct-1親和力更強(qiáng)［11］，3-磷酸甘油醛脫氫酶與Oct-1具有相互作用，可解釋二者共純化問(wèn)題［12］。超遷移分析表明，Oct-1能直接同變異型T-13910結(jié)合，且強(qiáng)于Oct-1與變異型C-13910之間的結(jié)合［13］。變異型C-13910和T-13910均能增強(qiáng)乳糖酶啟動(dòng)子的活性。對(duì)未分化的Caco-2細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，與包含C-13910的區(qū)域相比，包含T-13910的區(qū)域使乳糖酶啟動(dòng)子的活性增加25%～75%［14］。

3 乳糖酶的應(yīng)用

3.1 在乳產(chǎn)品中的應(yīng)用

3.1.1 解決結(jié)晶問(wèn)題由于乳糖結(jié)晶在濃縮乳制品或者冷凍制品中往往造成產(chǎn)品的(砂狀組織)缺陷，若在加工中添加20%～30%的乳糖水解酶，不但可以防止結(jié)晶現(xiàn)象發(fā)生，還可以增加產(chǎn)品的甜度，減少蔗糖用量。

3.1.2 發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用用乳糖水解乳制造酸乳，可以縮短乳凝固時(shí)間約15%～20%，且由于乳酸菌生長(zhǎng)快，菌數(shù)多，能延長(zhǎng)酸乳的貨架期，產(chǎn)品黏度也較大，若水解程度較大時(shí)，甜度也增加。因此，在制作水果酸乳時(shí)不僅可減少糖的用量，而且水果的風(fēng)味也會(huì)增強(qiáng);用乳糖水解乳加工干酪時(shí)，可縮短凝乳時(shí)間，并使凝塊堅(jiān)實(shí)，還可減少排除乳清時(shí)造成的損失，產(chǎn)量可增加10%。

3.1.3 作為替代添加劑乳清和超濾乳清中的乳糖部分水解可增加產(chǎn)品的甜味，提高糖的溶解度。不同比例的葡萄糖和半乳糖混合物的甜度相當(dāng)于蔗糖甜度的65%～80%，溶解度增加3～4倍，這種糖漿的總固形物含量達(dá)75%，可代替卵蛋白和蔗糖制作面包、餅干和蛋糕等，還可代替加糖濃縮牛乳制作牛乳軟糖等，且不會(huì)出現(xiàn)紋理、沙包、乳糖結(jié)晶和焦糖等現(xiàn)象。乳糖溶液經(jīng)乳糖酶水解形成半乳糖和葡萄糖的混合液，稱為半乳糖葡萄糖糖漿。其甜度與等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖相近?？纱嬲崽怯糜诟鞣N點(diǎn)心、飲料、罐頭食品及冰淇淋和雪糕的加工，效果很好。

“尉曰：‘今將軍尚不得夜行，何乃故也！’”原文用“曰”字，并沒(méi)有用表示霸陵尉態(tài)度的明顯詞語(yǔ)，而在英文翻譯中卻有“the watchman retorted”，“retorted”有反駁、回嘴之意，帶有抵抗意味。漢語(yǔ)原文中有很多都是直接“某某曰”，沒(méi)有表示人物情感態(tài)度的詞語(yǔ)，在英譯過(guò)程中加入表示情感態(tài)度變化的詞語(yǔ)，有助于讀者體會(huì)人物的心境。

3.1.4 低聚半乳糖的生產(chǎn)低聚半乳糖是以牛乳中的乳糖為原料，經(jīng)β-半乳糖苷酶催化水解半乳糖苷鍵，生成半乳糖和葡萄糖，并通過(guò)轉(zhuǎn)半乳糖苷的作用，將水解下來(lái)的半乳糖苷轉(zhuǎn)移到乳糖分子生成的。低聚半乳糖具有較強(qiáng)的耐酸性、耐熱性，不會(huì)因?yàn)樵诩庸み^(guò)程中的高溫殺菌及人體胃酸所分解而失去其本來(lái)應(yīng)有的特性，而且能有效地被雙歧桿B菌和乳酸桿A菌同時(shí)利用，因此低聚半乳糖的生產(chǎn)和應(yīng)用也相當(dāng)廣泛［15］，特別是在日本，隨著人們?cè)絹?lái)越注重健康，低聚半乳糖將會(huì)有很大市場(chǎng)。

3.2 促進(jìn)果蔬成熟及軟化

軟化是果實(shí)成熟的重要標(biāo)志，是一個(gè)復(fù)雜而有序的過(guò)程，涉及一系列生理生化反應(yīng)。果實(shí)成熟過(guò)程中初生細(xì)胞壁在細(xì)胞壁多糖降解酶的作用下，細(xì)胞壁多糖發(fā)生降解，高聚物解離，細(xì)胞壁組織變軟導(dǎo)致果肉軟化。乳糖酶可以使細(xì)胞壁的組分變得不穩(wěn)定，并通過(guò)降解具支鏈的多聚醛酸使果膠降解或溶解，使果實(shí)軟化。莊軍平等［16］利用已報(bào)道的乳糖酶基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，從香蕉果實(shí)中得到900 bp左右的1個(gè)片段，該片段的氨基酸序列與蘆筍、草莓、番茄、芒果及鱷梨等果實(shí)相應(yīng)的基因相似性分別是85.5%、80.9%、80.5%、79.1%、76.3%。

闞娟等［17］采用氣相色譜法測(cè)定不同成熟時(shí)期桃果實(shí)的乙烯釋放量以及ACC合成酶和ACC氧化酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)乳糖酶不同于多聚半乳糖醛酸酶，其作用主要與桃果實(shí)成熟前期果實(shí)的軟化啟動(dòng)密切相關(guān)。

3.3 乳糖酶作為檢測(cè)衰老細(xì)胞的標(biāo)志

1995年Dimri首次提出了一種可在體內(nèi)鑒別衰老細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志乳糖酶，報(bào)道中提出體內(nèi)或體外的衰老成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)此酶，而休眠細(xì)胞和終末分化細(xì)胞則缺乏，永生細(xì)胞中也無(wú)此酶的表達(dá)。因此此酶可以作為檢測(cè)衰老細(xì)胞的重要標(biāo)志。Kurz DJ等［18］基于一些間接生理實(shí)驗(yàn)得出衰老細(xì)胞溶酶體中的乳糖酶活性增加。陳俊香等［19］的研究結(jié)果表明隨增齡，大鼠腎組織乳糖酶表達(dá)逐漸增強(qiáng)。然而也有研究對(duì)此質(zhì)疑，Bo Yun Lee等［20］通過(guò)研究得出乳糖酶的活性之所以在衰老細(xì)胞中增加是通過(guò)溶酶體乳糖酶基因(GLB1)的編碼，而且在衰老細(xì)胞中溶酶體乳糖酶蛋白的表達(dá)也會(huì)增加，得出乳糖酶并不是衰老細(xì)胞的標(biāo)志。

3.4 在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

乳糖酶可作為助消化類藥物，適用于嬰兒各種消化不良癥，如原發(fā)性乳糖酶缺乏，因胃障礙及缺鐵所致的幼兒慢性腹瀉、幼兒及新生兒腹瀉等，且對(duì)新生兒無(wú)毒害作用。用于治療乳糖不耐受的乳糖酶藥物還可與其他抗生素聯(lián)用，與杜迪和思密達(dá)治療輪狀病毒腸炎能明顯有效地縮短病程，療效確切，治愈率高［21］。此類藥物可調(diào)整腸道正常菌群，拮抗輪狀病毒，對(duì)腸黏膜上皮細(xì)胞損傷有一定治療效果。很多藥物中都含有乳糖酶，如乳糖酶凍干酵母制劑、酵母乳糖酶腸溶微囊制劑等。

醫(yī)學(xué)上乳糖氫呼吸檢查(H(H(2)-BTs))被廣泛用于診斷乳糖酶缺陷，最常見(jiàn)的是乳糖不耐受癥狀的診斷，Oberacher M等［22］通過(guò)3個(gè)呼吸實(shí)驗(yàn)說(shuō)明這個(gè)呼吸測(cè)試對(duì)乳糖酶缺陷具有良好的敏感性和特異性，呼吸實(shí)驗(yàn)可以簡(jiǎn)化但時(shí)間無(wú)法縮短。研究發(fā)現(xiàn)對(duì)乳糖的分解能力也可作為一些疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志［23］，實(shí)驗(yàn)測(cè)試者對(duì)乳制品食物消化后，雙歧桿菌和大便乳酸菌的檢測(cè)表明某些疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和乳制品食物的攝入有關(guān)。對(duì)于乳糖不耐受的治療，用乳酸桿菌和半乳糖苷酶治療乳糖不耐癥的病人，通過(guò)氫呼吸實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知，乳酸桿菌和半乳糖苷酶都強(qiáng)烈提高胃腸道對(duì)乳糖的攝入吸收。由此可知益生菌對(duì)于乳糖不耐受治療持續(xù)性較好［24］。

3.5 乳糖酶基因在基因工程中的應(yīng)用

3.5.1 在載體構(gòu)建中的應(yīng)用乳糖酶基因編碼的產(chǎn)物水解底物X-gal，可呈現(xiàn)藍(lán)色，易于檢測(cè)和觀察，在構(gòu)建表達(dá)載體LacZ基因置于啟動(dòng)子下游，通過(guò)藍(lán)白斑來(lái)篩選陽(yáng)性重組載體。

3.5.2 作為報(bào)告基因的應(yīng)用乳糖酶是一種常用的報(bào)告基因分子，經(jīng)常與熒光素酶報(bào)告基因一起轉(zhuǎn)染細(xì)胞，被用作熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)的內(nèi)參照，從而消除因?yàn)橘|(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率不同而帶來(lái)的誤差。汪國(guó)忠等［25］以β-galactosidase質(zhì)粒為報(bào)告基因，將其與自制氟碳?xì)怏w微泡黏附，制備載基因微泡。利用診斷性超聲破裂微泡進(jìn)行體外心肌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染，采用原位染色及酶學(xué)定量檢測(cè)βgalactosidase表達(dá)水平，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。

其作為報(bào)告基因還用于研究啟動(dòng)子的效能和啟動(dòng)子不同位點(diǎn)突變對(duì)表達(dá)效能的影響。陳曉月等［26］為檢測(cè)構(gòu)建的枯草芽胞桿菌分泌表達(dá)載體

pGPST中啟動(dòng)子和信號(hào)肽的活性，將β-半乳糖苷酶基因插入表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建含有β-半乳糖苷酶基因的重組質(zhì)粒pGPST-lacZ。

3.5.3 構(gòu)建產(chǎn)乳糖酶基因工程菌利用基因工程技術(shù)，可以將活性高的乳糖酶基因?qū)胍子谂囵B(yǎng)、生產(chǎn)繁殖迅速的微生物體內(nèi)，從而降低乳糖酶生產(chǎn)成本。Domingues等［27］利用絮狀釀酒酵母和黑曲霉中含有編碼分泌胞外乳糖酶的LacA基因構(gòu)建重組菌株，使重組釀酒酵母菌株能夠分泌可高效利用乳糖的乳糖酶。Ibrahim等［28］使用化學(xué)誘變劑對(duì)2株雙歧桿菌、乳植桿菌和嗜熱鏈球菌進(jìn)行誘變，篩選高產(chǎn)菌株，長(zhǎng)雙歧的誘變菌株產(chǎn)酶量比野生型增加2倍多。為了獲得高產(chǎn)菌株，新基因工程菌不斷出現(xiàn)。生產(chǎn)酶的工程菌以大腸埃希菌、酵母菌為主，還有嗜熱鏈球菌、乳桿菌等［29］。

4 低溫乳糖酶的研究

由于低溫乳糖酶有其本身的優(yōu)越性，近年來(lái)已成為研究的熱點(diǎn)，很多科學(xué)家都開(kāi)始研究南極等那些常年冰封的土壤或者湖中的微生物［30-32］，已報(bào)道低溫乳糖酶產(chǎn)生菌有嗜冷菌和耐冷菌，通過(guò)16S rRNA序列分析可知，大多數(shù)低溫乳糖酶產(chǎn)生菌為節(jié)桿菌(Arthrobacter)和交替假單胞菌(Pseudoalteromonas)［33］。

在我國(guó)，周春雷等［34］從北冰洋楚科奇海、加拿大海盆、格陵蘭海和中國(guó)南極中山站近岸的海水、海冰和沉淀物樣品中分離出322株低溫細(xì)菌中篩選出73株低溫乳糖酶產(chǎn)生菌，通過(guò)研究其產(chǎn)生的乳糖酶具有較好的適應(yīng)低溫特性。馬宏偉等［35］從內(nèi)蒙古寶格達(dá)山高山凍土以及乳制品中分離到25株嗜冷菌，利用產(chǎn)低溫β-半乳糖苷酶模型篩選，獲得1株低溫酶高產(chǎn)菌株。史應(yīng)武等［36］從新疆高寒凍土、冷凍乳制品及生乳中分離到101株耐冷菌，利用低溫β-半乳糖苷酶篩選模型，獲得1株低溫酶高產(chǎn)菌株，并且對(duì)菌特性和酶特性進(jìn)行了研究。

1株新的具有低溫乳糖酶活性的菌株從北極的土壤中被分離出來(lái)，對(duì)應(yīng)的基因被克隆并且在大腸埃希菌中表達(dá)，分析DNA序列得知其屬于糖基化水解酶家族2［37］。Bia?kowska AM等［38］從南極土壤中分離出的節(jié)桿菌屬的菌20B，其本身是低溫菌，且產(chǎn)的乳糖酶也是低溫酶，Wang K等［39］從土壤基因組文庫(kù)中分離出一種新的β-半乳糖基因ZD410，分析結(jié)果表示，該序列編碼的蛋白由672個(gè)氨基酸組成，其分子量為78.6 ku，由于此基因表達(dá)的β-半乳糖苷酶在低溫條件下有較高活性，把此種酶認(rèn)定為一種低溫酶。James A等［40］發(fā)現(xiàn)微小的結(jié)構(gòu)基因的改變都會(huì)影響乳糖酶的熱穩(wěn)定性，bgaS3基因有在低溫環(huán)境下恢復(fù)蛋白活性的作用，BgaS26和BgaS7基因改變的酶和含有BgaS基因的酶有相似的最適溫度和熱穩(wěn)定性。BgaS7提高了酶在15℃的活性，而且在2.5℃水解80%的乳糖酶所用的時(shí)間是BgaS的一半。

5 結(jié)論

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人們對(duì)乳糖酶的進(jìn)一步研究，乳糖酶的應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，將來(lái)乳糖酶的應(yīng)用就不僅僅局限于解決乳糖不耐受問(wèn)題，還將在食品、醫(yī)藥、環(huán)保、基因治療等各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

由于近年來(lái)低溫乳糖酶的研究成為熱點(diǎn)，乳糖酶的生產(chǎn)成本也將大幅降低，乳糖酶的適應(yīng)性也將提高。目前，本實(shí)驗(yàn)室也正在從我國(guó)寒冷地區(qū)的土樣中對(duì)低溫乳糖酶產(chǎn)生菌株進(jìn)行篩選并且將克隆其基因到大腸埃希菌中表達(dá)，隨著研究的深入，低溫乳糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)及其在各個(gè)方面的應(yīng)用將會(huì)逐步實(shí)現(xiàn)。

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