淋病奈瑟菌感染實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)的進(jìn)展

廖遠(yuǎn)泉，廖暉

安徽省涇縣醫(yī)院，宣城 242500

淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae，NG)是淋病的病原菌，有嚴(yán)格的人類寄生性，對人體有很強(qiáng)的適應(yīng)性和侵襲力。淋病是發(fā)展中國家發(fā)病率最高的傳染病之一[1]，也是目前國內(nèi)發(fā)病率最高的性病[2]。感染 NG 初期，人體常無臨床癥狀，但若得不到及時診療可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的泌尿生殖道疾病，尤其是女性患者常導(dǎo)致盆腔炎或繼發(fā)不孕不育。因此，及時準(zhǔn)確診斷NG感染已成為治療淋病的關(guān)鍵。病原菌培養(yǎng)是臨床檢驗(yàn)診斷NG感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，是目前診斷淋病最可靠的方法。但是，NG耐藥性也逐年上升，多重耐藥菌的出現(xiàn)使NG培養(yǎng)日趨困難。因此，NG的檢驗(yàn)診斷技術(shù)研究備受關(guān)注?，F(xiàn)就NG感染實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)的研究進(jìn)展予以綜述。

1 NG感染的病原學(xué)檢驗(yàn)

1.1 分泌物直接涂片染色鏡檢

常用革蘭染色法，亦可采用亞甲藍(lán)染色或瑞氏染色。安邦權(quán)等[3]應(yīng)用瑞氏染色和革蘭染色同時檢測男性患者尿道分泌物中的 NG，檢出率均明顯高于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法；龔匡隆等[2]對男性患者尿道分泌物標(biāo)本應(yīng)用亞甲藍(lán)染色，同時做NG 培養(yǎng)和衣原體抗原檢測，提示隨著尿道多形核白細(xì)胞數(shù)升高，NG 感染的危險性不斷增高。但是，直接涂片法有其局限性。熊禮寬[4]指出，男性患者分泌物直接涂片革蘭染色后鏡檢，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)存在革蘭陰性雙球菌，可結(jié)合臨床表現(xiàn)作出初步診斷。但男性慢性淋病患者NG常位于細(xì)胞外，應(yīng)加以注意。對女性患者，即使分泌物涂片染色后見革蘭陰性雙球菌，仍不能診斷，應(yīng)該繼續(xù)做培養(yǎng)和鑒定，以排除灰色奈瑟菌、不動桿菌和卡他莫拉菌等。因此，分泌物直接涂片染色鏡檢用于臨床診斷NG 感染價值有限。

1.2 NG的培養(yǎng)與鑒定

1.2.1 NG分離培養(yǎng)基

1.2.1.1 Thayer-Martin培養(yǎng)基 NG營養(yǎng)要求高，在普通血瓊脂和營養(yǎng)瓊脂上均不易生長，如在培養(yǎng)基中加入血紅蛋白、血清或腹水(或鮮牛肉汁)等，NG發(fā)育較好。但病原菌常因取材部位其他共生菌的影響而導(dǎo)致初次分離失敗。該培養(yǎng)基含有的瑞斯托霉素和多黏菌素B能有效抑制黏膜部位的其他共生菌，經(jīng)改良后目前已廣泛應(yīng)用。配方主要是在巧克力血瓊脂中加入4種選擇性抑制劑，其中3～4 μg/ml萬古霉素能同時抑制對其敏感的NG，0.3%～30%的目的菌被抑制；但這4種選擇性抑制劑還不能有效抑制表皮葡萄球菌、白假絲酵母(白色念珠菌)及某些腸桿菌等，分離結(jié)果欠佳。

1.2.1.2 GC-Lect培養(yǎng)基 在改良Thayer-Martin (modified Thayer-Martin，MTM)配方基礎(chǔ)上改進(jìn)，其選擇性和分離靈敏度顯著提高。陳秀樞等[5]臨床檢測結(jié)果顯示，GC-Lect培養(yǎng)基上非目的菌生長率僅9.4%，與MTM培養(yǎng)基相比具有顯著意義(P<0.0001)。配方由GC-Ⅱ瓊脂基礎(chǔ)、牛血紅蛋白、Isovitale X(V因子)、1 μg/ml林可霉素、2 μg/ml萬古霉素等組成。因?yàn)槿f古霉素對NG最小抑制濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)<2 μg/ml的概率很低，所以提高了NG的臨床分離率。國內(nèi)也研制了卵黃雙抗等培養(yǎng)基，但臨床應(yīng)用評價鮮有報道。

1.2.2 NG的常規(guī)分離培養(yǎng)及其感染的快速鑒定

將臨床采樣后的標(biāo)本即時接種在預(yù)溫的NG專用培養(yǎng)基上(采樣拭子表面與濕潤的培養(yǎng)基平面滾動接觸呈“Z”字型，再用接種環(huán)劃線接種)，置于5%的CO2潮濕環(huán)境35 ℃培養(yǎng)24～48 h；取可疑菌落涂片、染色、鏡檢，氧化酶試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)鑒定為NG，才可確診為淋病。分離和純化的細(xì)菌培養(yǎng)物亦可應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的DNA探針雜交試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、單克隆熒光抗體試驗(yàn)等[6]。細(xì)菌培養(yǎng)的敏感度和特異度高，目前仍是診斷淋病的最可靠方法，且適合各種臨床標(biāo)本，分離的菌株還可供藥敏試驗(yàn)。但NG在人體外抵抗力極弱，對冷、熱、干燥和化學(xué)消毒劑敏感，臨床標(biāo)本的采集、輸送及接種方式等也可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。而且，NG的營養(yǎng)要求特殊，常規(guī)生化反應(yīng)鑒定不易進(jìn)行。因此，呂火祥等[7]在MTM培養(yǎng)基中加入葡萄糖、脫纖維綿羊血，使培養(yǎng)基中的營養(yǎng)更加豐富，以誘導(dǎo)NG產(chǎn)生較多量的胞外酶，更易生長，并研制了專用的微量生化反應(yīng)板以快速鑒定NG。試劑Superoxol為高濃度的H2O2，以檢測NG特有的過氧化物歧化酶。NG專用微量生化反應(yīng)板法操作簡便、快速，結(jié)果可靠，對分離于口腔及直腸部位的NG鑒定尤具臨床意義。

2 NG感染的免疫學(xué)檢測

2.1 斑點(diǎn)免疫金滲濾試驗(yàn)、生物素-鏈霉親和素一步法

董玉娥等[8]在成功制備抗NG單克隆抗體基礎(chǔ)上，利用生物素、親和素的高親和性和放大作用以及單克隆抗體的特異性，建立了一步法檢測NG技術(shù)，在細(xì)菌培養(yǎng)的同時檢測臨床擬診淋病患者。該法與NG培養(yǎng)符合率較好，比常規(guī)免疫酶法節(jié)省時間，不需特殊設(shè)備，且操作簡便，可接受大量樣本檢測，更適合于流行病學(xué)調(diào)查。檢測NG抗原一步法是簡易、快速、敏感、特異的免疫學(xué)檢測方法。

2.2 協(xié)同凝集試驗(yàn)

葡萄球菌A蛋白(staphylococal protein A，SPA)具有與人及各種哺乳動物IgG Fc段結(jié)合的能力，而不影響抗體Fab段活性。所以，應(yīng)用抗體致敏SPA的協(xié)同凝集試驗(yàn)檢測NG簡便、實(shí)用。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

應(yīng)用單克隆抗體固相酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測男性急性NG感染者尿道分泌物，結(jié)果較滿意，但不宜用于女性及口腔(或)直腸部位NG感染者。

3 NG感染的分子生物學(xué)檢測

3.1 聚合酶鏈反應(yīng)

王振勇等[9]應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和細(xì)菌培養(yǎng)分別檢測192例生殖道感染者的NG，結(jié)果顯示兩者具有高度的一致性。Bhalla 等[10]的研究也表明，NG培養(yǎng)與PCR檢測NG的陽性率一致。

PCR是分子生物學(xué)中最常用檢測基因的技術(shù)手段，也是NG基因診斷中最基本的方法。PCR引物的設(shè)計應(yīng)選擇與其相應(yīng)的靶基因，多采用外膜蛋白抗原基因、隱蔽性質(zhì)粒DNA或16S RNA基因。目前，實(shí)驗(yàn)室檢測NG常用的靶基因有porA、opa、Roche COBAS?AMPLICOR和ompⅢ等。Whiley等[11]選擇NGporA基因，應(yīng)用熒光定量PCR擴(kuò)增其132 bp序列，具有較高的敏感度和特異度。研究發(fā)現(xiàn)，opa、ompⅢ基因與其他靶基因位點(diǎn)出現(xiàn)重組的概率很低，可以降低試驗(yàn)的假陽性及假陰性。此外，opa系多拷貝基因，某些菌株多達(dá)11個基因位點(diǎn)，引物設(shè)計用opa(或多個靶基因聯(lián)合應(yīng)用)作為靶基因，可顯著提高檢測NG的敏感度[12]。亦可選擇與其耐藥相關(guān)的基因設(shè)計特異性引物，應(yīng)用PCR等技術(shù)檢測NG的耐藥性。

3.2 連接酶鏈反應(yīng)

連接酶鏈反應(yīng)(ligase chain reaction，LCR)是繼PCR之后建立起來的快速DNA擴(kuò)增方法，其特異性高于PCR[13]。Page-Shafer等[14]應(yīng)用LCR檢測NG感染者咽拭子標(biāo)本，結(jié)果顯示敏感度為94.7%，特異度為97.8%；其敏感度顯著高于細(xì)菌培養(yǎng)。彭學(xué)標(biāo)等[15]對170例性病門診女性就診者做宮頸拭子NG培養(yǎng)和尿液標(biāo)本LCR檢測，根據(jù)“擴(kuò)大的金標(biāo)準(zhǔn)”確定LCR的檢測結(jié)果，結(jié)果顯示LCR的敏感度為94.1%，特異度為100%。收集尿液標(biāo)本檢測方便易行，尤其易為無癥狀患者接受。LCR操作便捷，適宜做大規(guī)模的性病普查，使女性無癥狀感染者篩查的陽性率顯著增加。但其仍需完善的質(zhì)量控制，應(yīng)注意避免污染導(dǎo)致的假陽性或抑制物所致的假陰性。

3.3 實(shí)時熒光定量PCR及自身淬滅探針定量PCR

Applied Biosystems于1996年研究建立了實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，實(shí)驗(yàn)原理[16]是將熒光能量傳遞技術(shù)應(yīng)用于常規(guī)PCR儀中。即在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)或熒光染料，利用熒光信號積累，實(shí)時監(jiān)測整個PCR過程，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板濃度進(jìn)行定量分析。Geraats-Peters等[17]將opa基因作為靶基因，設(shè)計了2條熒光探針，并以傳統(tǒng)的16S rRNA及COBAS擴(kuò)增結(jié)果作為對照。研究表明，opa基因檢測結(jié)果較16S rRNA 敏感度高，且未出現(xiàn)假陽性或假陰性。定量PCR快速、準(zhǔn)確、可靠，但昂貴的熒光檢測儀和熒光標(biāo)記探針限制其廣泛應(yīng)用。許箐[18]對臨床疑似性病患者的檢測結(jié)果也表明，定量PCR檢測NG的陽性率顯著高于細(xì)菌培養(yǎng)法。

利用構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-11Zf-CPP作為標(biāo)準(zhǔn)品，陳茶等[19]在定量PCR基礎(chǔ)上設(shè)計了自身淬滅探針定量PCR以檢測NG。王箭等[20]對59例疑為NG感染者的檢測結(jié)果表明，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為102～107拷貝/μl時，自身淬滅定量PCR線性關(guān)系良好，其陽性率高于細(xì)菌培養(yǎng)的陽性率，兩者特異度均為100%。自身淬滅定量PCR實(shí)現(xiàn)了PCR擴(kuò)增、熒光探針雜交及檢測一體化，簡便、省時。

3.4 膜基因芯片技術(shù)

NG和沙眼衣原體是性病的重要病原體。多種病原體?；旌细腥?，且一種病原體的感染對另一種可能具有激活和促進(jìn)作用。向華國等[21]利用多重PCR結(jié)合尼龍膜技術(shù)，建立了新的多重PCR-反向線點(diǎn)雜交技術(shù)(PCR-based reverse line blot hybridization assay，PCR-RLB)，快速檢測NG等病原體感染。分別選擇編碼NG大亞基核糖體16S rRNA基因和沙眼衣原體隱蔽質(zhì)粒設(shè)計2對特異性引物，并以支原體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列設(shè)計1對支原體屬通用引物，用生物素標(biāo)記下游引物，構(gòu)建三重PCR同時擴(kuò)增NG等病原體DNA，與固定在膜上的各特異性寡核苷酸探針雜交。對142份性病高危人群標(biāo)本的檢測結(jié)果表明，多重PCR可同時擴(kuò)增NG等病原體DNA，其中NG的PCR產(chǎn)物為414 bp。膜芯片技術(shù)無放射性污染；化學(xué)發(fā)光檢測具有檢測信號放大作用，敏感度高；尼龍膜結(jié)合單鏈及雙鏈DNA/RNA的能力較硝酸纖維素膜強(qiáng)，可達(dá)350～500 μg/cm2，經(jīng)洗脫處理可多次使用。該技術(shù)還可用于無癥狀人群的性病初篩檢驗(yàn)，具有快速、敏感的特點(diǎn)。

3.5 單管多重PCR

鑒于性病常由多種病原體混合感染引起，唐文志等[22]應(yīng)用單管多重PCR對臨床疑似性病感染者標(biāo)本以雙盲法檢驗(yàn)，并以熒光定量PCR加細(xì)菌培養(yǎng)作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，確診的119例性病陽性(包括40例混合感染)和66例性病陰性病例與單管多重PCR檢測結(jié)果相符。該技術(shù)的敏感度為10-9fg/μl，特異度為100%，符合率為98.3%。

建立在PCR/多重PCR基礎(chǔ)上的膜基因芯片技術(shù)或單管多重PCR檢測性病單一或多重感染，具有簡便、快速、準(zhǔn)確可靠、經(jīng)濟(jì)適用等優(yōu)點(diǎn)，備受檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)界的青睞。聯(lián)合檢測多種病原體的臨床檢驗(yàn)診斷技術(shù)已成為病原生物學(xué)基因診斷領(lǐng)域新的發(fā)展趨勢。

4 NG的分型及其耐藥性檢測

NG的分型方法主要有血清學(xué)分型、營養(yǎng)分型和基因分型方法。傳統(tǒng)的分型方法根據(jù)NG菌毛的有無分為5個型(T1～T5)。目前，分子生物學(xué)基因分型技術(shù)應(yīng)用較多，如脈沖場凝膠電泳(pulse field gel electrophoresis, PFGE)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分型(random amplified polymorphic DNA，ARPD)、opa分型、por分型、多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)等。多克隆抗體凝集試驗(yàn)分型也簡便、實(shí)用。隨著淋病發(fā)病率增加，NG耐藥性上升，出現(xiàn)了多重耐藥菌并廣泛傳播，產(chǎn)青霉素酶NG(penicillinase-producingNeisseriagonorrhoeae，PPNG)等耐藥菌株的分離鑒定對淋病治療首選藥物的合理應(yīng)用具有重要意義。

4.1 NG分型

Aydin等[23]應(yīng)用細(xì)菌營養(yǎng)學(xué)、血清學(xué)和opa基因分型技術(shù)對分離于男性尿道炎患者尿道分泌物的56株NG進(jìn)行分型，結(jié)果分別為8、33和55個型別；其中以opa基因分型技術(shù)的鑒定指數(shù)最高，為0.999。郭光輝等[24]應(yīng)用重復(fù)序列PCR對12株P(guān)PNG分型，分為6種，其中A型6株，F(xiàn)型2株，B、C、D、E型各1株，主要流行株為A型。通過分型研究，可了解NG感染的流行特征，為調(diào)查和控制其傳播途徑及傳染源提供流行病學(xué)依據(jù)。

4.2 NG耐藥性檢測及質(zhì)粒譜型分析

PPNG對青霉素等抗生素的耐藥性，大多由質(zhì)粒介導(dǎo)，其耐藥性可在NG間及其他菌屬間傳播。侯存軍等應(yīng)用瓊脂稀釋法測定148株NG對4種抗生素的MIC及其中70株NG的質(zhì)粒圖譜，提示NG對多種抗生素耐藥，PPNG陽性率達(dá)28.38%～40.20%；頭孢曲松和大觀霉素是目前治療NG感染的首選藥物；質(zhì)粒圖譜顯示地域特殊性[25,26]，但已出現(xiàn)耐大觀霉素菌株[27]。按照美國疾病預(yù)防控制中心規(guī)范，當(dāng)某病原體對某種抗生素耐藥率>5%時，該抗生素就不應(yīng)作為治療該病原體感染的首選藥物。因此，環(huán)丙沙星、青霉素、四環(huán)素等不應(yīng)再作為臨床治療淋病的有效藥物。

5 結(jié)語

綜上所述，淋病的病原學(xué)研究必須以NG的分離、培養(yǎng)為基礎(chǔ)。新的NG感染檢驗(yàn)診斷技術(shù)已在臨床應(yīng)用，雖然還有不足或缺陷，但隨著分子生物學(xué)及相關(guān)學(xué)科的深入發(fā)展、基層醫(yī)療條件的不斷改善、檢驗(yàn)試劑標(biāo)準(zhǔn)和操作規(guī)程的進(jìn)一步規(guī)范，其在 NG感染及其他性病的臨床診斷中一定具有更廣闊的應(yīng)用前景。

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