血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合肝動脈化療栓塞對大鼠肝癌移植瘤組織血管生成的影響*

張寶南,魏治鵬

無錫市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科無錫 214001

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤,肝動脈化療栓塞術(shù)(TACE)是常見的中晚期肝癌的重要治療手段,但TACE很難達(dá)到手術(shù)治療效果,復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響長期療效的主要原因[1]?；颊逿ACE后檢測的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平往往升高,提示腫瘤周圍血管形成和側(cè)支循環(huán)建立[2],因此抗腫瘤血管生成治療有可能改善TACE的療效。血管內(nèi)皮抑素是抗血管生成代表藥物,能特異性作用于新生血管內(nèi)皮細(xì)胞,對抗VEGF的促血管生成而發(fā)揮作用[3-4]。作者建立雄性成年Wistar大鼠肝癌移植瘤模型,采用重組人血管內(nèi)皮抑素(rh-Endostatin,YH-16)聯(lián)合TACE進(jìn)行治療,觀察腫瘤組織內(nèi)VEGF的表達(dá)和微血管密度(microvessel density,MVD),了解YH-16在抗腫瘤血管生成中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與動物 40只雄性成年Wistar大鼠(體質(zhì)量180～250 g)和5只傳種Wistar幼鼠均購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞所動物房。Walker-256瘤株購自上海醫(yī)藥工業(yè)研究院。鼠抗人VEGF免疫組化試劑盒購自美國Lab Vision公司(上海晶美生物工程有限公司代理),兔抗人CD34單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。阿霉素購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司,超液化碘油購于法國Cuerbet公司。YH-16由江蘇先聲藥業(yè)有限公司提供,15 mg(3 mL/支),4℃冰箱貯藏,避免劇烈振蕩。

1.2 栓塞劑配制 阿霉素碘化油乳劑制備:取阿霉素50 mg+超液化碘油10 mL充分乳化;YH-16-阿霉素碘化油乳劑制備:取YH-16 30 mg混入阿霉素碘化油乳劑中充分乳化。

1.3 大鼠肝癌移植瘤模型的建立 無菌條件下,將瘤株從液氮中復(fù)蘇并增殖至4×106m L-1,注入傳種大鼠腹腔,1周后大鼠出現(xiàn)癌性腹水,抽出癌性腹水0.5～1.0mL注入另一只大鼠皮下,1周后皮下長出1 cm3大小實體瘤,將荷瘤大鼠處死,無菌條件下取出實體瘤,局部消毒,去除纖維組織,挑選無出血、壞死腫瘤組織,切成2mm×2 mm×2 mm備用。另取大鼠40只,以戊巴比妥鈉按40 mg/kg腹腔注射麻醉,大鼠取仰臥位,四肢固定于手術(shù)板上后,術(shù)區(qū)用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇消毒,腹正中切開皮膚1.0 cm左右,用顯微組織鑷子將肝包膜戳一小口,將腫瘤塊沿隧道嵌入,明膠海綿堵塞竇口,完畢后逐層縫合腹壁,飼養(yǎng)待用。術(shù)后肌內(nèi)注射慶大霉素40 kU/d預(yù)防感染。

1.4 分組與處理 采用隨機(jī)數(shù)字表將40只造模成功大鼠分為對照組與觀察組,各 20只,再次麻醉后固定,剖腹暴露肝臟,分離胃十二指腸動脈、肝動脈及肝固有動脈,結(jié)扎胃十二指腸動脈遠(yuǎn)端,以銀夾暫時阻斷肝總動脈,于手術(shù)顯微鏡下在胃十二指腸動脈上切一小口,插入特制微導(dǎo)管,上行進(jìn)入肝固有動脈,待回血后,對照組大鼠肝動脈內(nèi)注入 2～3 m L/ kg阿霉素碘化油乳劑,觀察組給予2～3mL/kg YH-16-阿霉素碘化油乳劑,灌注后拔管,結(jié)扎胃十二指腸動脈近端,開放肝總動脈,逐層縫合切口后擦凈傷口,外涂金霉素軟膏,分籠、恒溫、自動供水供食飼養(yǎng)。7 d后處死所有大鼠,剖腹留取腫瘤組織,備用。

1.5 VEGF和MVD的免疫組化檢測 組織標(biāo)本常規(guī)脫水,石蠟包埋,4μm連續(xù)切片,采用SABC法進(jìn)行免疫組化染色。VEGF一抗工作濃度為1∶200,MVD一抗工作濃度為1∶50。以PBS替代一抗作陰性對照。VEGF表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或褐黃色顆粒為陽性。高倍鏡下每張切片采用圖像分析儀選取 5個視野,每視野計數(shù) 100個細(xì)胞,計算陽性細(xì)胞百分率。參照Weidner方法并加以改進(jìn)進(jìn)行微血管計數(shù),凡是染成棕色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞成簇出現(xiàn),并與相鄰血管、腫瘤細(xì)胞以及間質(zhì)成分相分隔的,作為一個微血管計數(shù);首先在低倍鏡下觀看全片,尋找腫瘤內(nèi)血管清楚且微血管數(shù)最多的區(qū)域,然后在高倍鏡下計數(shù)這一視野的微血管數(shù)[5]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 12.0進(jìn)行分析,采用兩獨立樣本t檢驗比較2組癌組織中VEGF的表達(dá)和MVD,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

移植瘤組織中VEGF和MVD檢測結(jié)果見圖1、表1。

圖1 2組大鼠移植瘤組織中VEGF(A)和MVD(B)的表達(dá)1:對照組;2:觀察組。

表1 2組癌組織中VEGF和MVD的檢測結(jié)果

3 討論

血管內(nèi)皮抑素被視為抗腫瘤血管生成治療中最具前途的藥物之一,能封堵VEGF受體VEGFR-1 (Flk-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)和VEGFR-3(Flk-4),阻斷VEGF介導(dǎo)的信號傳導(dǎo);阻止血管內(nèi)皮細(xì)胞與VEGF的結(jié)合,下調(diào)VEGF mRNA和蛋白表達(dá),從而抑制VEGF介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成。其抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力是已發(fā)現(xiàn)的血管抑制素的數(shù)倍,且作用與劑量呈正相關(guān),不抑制其他細(xì)胞的生長,無化療藥物的毒副作用[2,6-9]。

通過介入治療中的導(dǎo)管技術(shù)將化療藥物送達(dá)腫瘤供血動脈可延長藥物和腫瘤細(xì)胞的接觸時間,提高局部的藥物濃度,減少全身反應(yīng)[10]。單純的TACE主要針對已經(jīng)生成的腫瘤血管,對新生的血管無栓塞作用;而血管內(nèi)皮抑素主要抑制腫瘤新生血管,對于已經(jīng)形成的血管作用不大。二者聯(lián)合可以互補,在阻斷腫瘤供血的同時抑制新生血管的生成,從而達(dá)到致腫瘤壞死同時抑制新生腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的作用[11]。

作者的實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,觀察組大鼠Walker-256肝癌移植瘤組織內(nèi)VEGF的表達(dá)和MVD表達(dá)下降,提示YH-16使腫瘤新生血管的形成明顯減少,YH-16聯(lián)合TACE可有效對抗血管生成。

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