表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑對(duì)外源鋅離子致大鼠急性呼吸道炎癥的影響*

賈陳志,關(guān)文池,李 冰,梁 寧,燕 貞,王 威,吳逸明,吳衛(wèi)東#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室鄭州 450001 2)廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系廈門(mén) 361005

#通訊作者,男,1963年10月生,博士,教授,研究方向:分子毒理學(xué),E-mail:wdwu98@gmail.com

大氣中鋅離子主要存在于微細(xì)顆粒物中,可以多種形式存在,主要包括硫酸鋅、氧化鋅和氯化鋅。環(huán)境流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果[1-2]表明,長(zhǎng)期吸入空氣中含鋅顆粒物與當(dāng)?shù)鼐用窈粑到y(tǒng)炎癥性疾病(如慢性支氣管炎、支氣管哮喘)發(fā)病率的升高有密切關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果[3]顯示,含鋅化合物可提高人支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)白細(xì)胞介素8(interleukin-8, IL-8)的表達(dá)。發(fā)生肺部炎癥的大鼠支氣管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid,BALF)中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和總蛋白含量升高[4]。外源鋅離子可激活呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)分子,如表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor recep tor, EGFR)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B, PI3K-PKB)等[5]。但是這些信號(hào)傳導(dǎo)分子在鋅離子致呼吸道損傷過(guò)程中的作用還不清楚。課題組前期研究[6]觀察到外源性鋅離子有磷酸化(即活化)人呼吸道上皮細(xì)胞EGFR作用,因此推斷EGFR可能在鋅離子致呼吸道炎癥過(guò)程中發(fā)揮重要作用。為證實(shí)推論,作者進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 試劑 硫酸鋅(天津凱通化學(xué)試劑有限公司),EGFR抑制劑PD153035(美國(guó)Calbiochem公司),二甲基亞砜(DMSO,美國(guó)Sigma公司),IL-8、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、ELISA試劑盒(美國(guó)RD Biosciences公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)對(duì)象:13周齡清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠50只,體質(zhì)量100～130 g,購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào)scxk(豫)2005-0001。實(shí)驗(yàn)分兩個(gè)階段。第一階段探討硫酸鋅引起大鼠急性呼吸道炎癥最明顯的時(shí)間點(diǎn)。30只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表分為 6組,每組 5只,大鼠先用乙醚麻醉,然后采用支氣管灌注法分別給予PBS或100μmol/L硫酸鋅溶液(灌注劑量1m L/kg),分別于灌注后4、8、24 h處死。第二階段探討預(yù)灌注PD153035對(duì)硫酸鋅作用的影響。20只大鼠隨機(jī)分為4組(分別用PD153035和硫酸鋅、PD153035和PBS、DMSO和硫酸鋅以及DMSO和PBS灌注處理),每組5只,先用DMSO或1 μmol/L PD153035溶液預(yù)灌注,灌注劑量0.5m L/kg,約30min后再按照同樣方法分別灌注PBS和硫酸鋅溶液。處理時(shí)間參考第一階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 呼吸道炎癥指標(biāo)檢測(cè)方法 大鼠頸椎脫臼處死,每只用5m L生理鹽水進(jìn)行肺灌洗2次,取BALF混勻,先進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù),然后2 000 r/m in離心10 min,取上清液用于總蛋白(考馬斯亮藍(lán)法)、IL-8蛋白和LDH含量檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0進(jìn)行分析。應(yīng)用 2×3析因設(shè)計(jì)方差分析,比較不同灌注液及時(shí)間對(duì)大鼠急性呼吸道炎癥的影響,篩選最佳時(shí)間;應(yīng)用2×2析因設(shè)計(jì)方差分析,比較預(yù)灌注液和灌注液的主效應(yīng)及其交互作用。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 硫酸鋅對(duì)大鼠呼吸道各炎癥指標(biāo)的影響 見(jiàn)表1。灌注硫酸鋅8 h時(shí)各炎癥指標(biāo)均高于4 h和24 h。

2.2 EGFR抑制劑對(duì)硫酸鋅致大鼠呼吸道炎癥指標(biāo)的影響 見(jiàn)表2。

表1 硫酸鋅對(duì)大鼠呼吸道各炎癥指標(biāo)的影響(n=5)

表2 EGFR抑制劑對(duì)硫酸鋅致大鼠呼吸道炎癥指標(biāo)的影響(n=5)

3 討論

EGFR廣泛分布于上皮組織中,參與呼吸道上皮細(xì)胞膜的修復(fù)等生理反應(yīng),在呼吸道炎癥發(fā)生過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用[7],另外在肺癌組織中大量表達(dá)[8]。PD153035是EGFR酪氨酸激酶的特異性抑制劑,能選擇性地阻止 EGF介導(dǎo)的細(xì)胞有絲分裂、基因表達(dá)和細(xì)胞癌變[9]。

為闡明EGFR抑制劑對(duì)鋅離子誘發(fā)呼吸道炎癥的影響,研究者先制備大鼠呼吸道炎癥模型。由于硫酸鹽在細(xì)胞代謝和哺乳動(dòng)物的發(fā)育過(guò)程中起重要作用,硫酸根離子維持著機(jī)體的酸堿平衡[10],且硫酸鋅是鋅離子在空氣顆粒物中主要的存在形式,因此研究者使用氣管灌注硫酸鋅的方法誘發(fā)動(dòng)物呼吸道炎癥。結(jié)果顯示,BALF中各指標(biāo)均較對(duì)照組明顯升高,以灌注 8 h最明顯,提示硫酸鋅可誘發(fā)大鼠急性呼吸道炎癥。

進(jìn)一步用EGFR抑制劑PD153035(溶解于DMSO)預(yù)灌注大鼠呼吸道,并用DMSO為對(duì)照,在灌注硫酸鋅和PBS 8 h后觀察炎癥變化。研究結(jié)果顯示PD153035預(yù)灌注組各炎癥指標(biāo)均比DMSO預(yù)灌注組減弱,提示 PD153035可明顯抑制硫酸鋅對(duì)大鼠呼吸道的炎性損傷作用。至于硫酸鋅是通過(guò)何種機(jī)制激活EGFR以及EGFR又是通過(guò)何種機(jī)制介導(dǎo)硫酸鋅的炎癥作用,尚有待深入研究。

綜上所述,呼吸道灌注硫酸鋅可誘發(fā)大鼠呼吸道急性炎癥,EGFR抑制劑PD153035能夠有效抑制硫酸鋅誘發(fā)的呼吸道急性炎癥。

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